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微生物电子教案


第一节 一、 什么是微生物? 微生物 (microorganism,microbe)

微生物与微生物学

通俗定义:使一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称。一般只有借助显微镜才能其进行观察。 专业定义:微生物是所有形体微小的单细胞或个体结构较简单的多细胞,以及没有细胞结构的低等生物 的通称。 二、 微生物的五大共性 (一)体积小,面积大 杆菌的平均长度:2μ m 1500 个杆菌首尾相连= 一粒芝麻的长度 10-100 亿个细菌加起来重量 = 1 毫克 比面值大:比面值 = 表面积/体积 = 3/r 人 = 1;大肠杆菌 = 30 万; 这样大的比表面积特别有利于它们和周围环境进行物质、能量、信息的交换,并由此而产生其余 4 个共 性。 (二)吸收多,转化快 胃口大 消耗自身重量 2000 倍食物的时间: 大肠杆菌:1 小时;人:500 年(按 400 斤/年计算) (三)生长旺,繁殖快 微生物以惊人的速度“生儿育女”。 大肠杆菌一个细胞重约 10 –12 克,平均 20 分钟繁殖一代 24 小时后: 4722366500 万亿个后代,重量达到:4722 吨 48 小时后:2.2 × 1043 个后代,重量达到 2.2 × 1025 吨 相当于 4000 个地球的重量!!! (四)分布广,种类多 物种的多样性 生理代谢类型的多样性 代谢产物的多样性 遗传基因的多样性 生态类型的多样性 无处不在,食谱广

微生物获取营养的方式多种多样,其食谱之广是动植物完全无法相比的! 纤维素、木质素、几丁质、角蛋白、石油、甲醇、甲烷、天然气、塑料、酚类、氰化物、各种有机物均 可被微生物作为粮食。 (五)适应强,易变异 微生物具有极其灵活的适应性或代谢调节机制。 微生物对恶劣的环境有惊人的适应力。 Eg. 高温、高酸、高盐、高辐射、高压、高碱、高毒、低温等。 抗热:265 个大气压,250 ℃;最高生长温度可以达到 113 ℃ ; 芽孢需加热煮沸 8 小时才被杀死。 抗寒:―12℃ ~ ―30℃ 抗酸碱:pH 0.5 ~ 13; 耐渗透压:蜜饯、腌制品,饱和盐水(NaCl 32%) 抗压力:有些细菌可在 1400 个大气压下生长; 个体小、结构简单、且多是单细胞,繁殖快、数量多, 与外界环境直接接触等特点,使微生物易发生变异。 突变率:10-5 – 10-10 短时间内产生大量的变异后代 青霉素的生产: 青霉素的用量:最高:10 万单位/天(40 年代) 青霉素抑菌: 细菌抗药性的产生: 三 、微生物学 微生物学(Microbiology)是一门在细胞、分子或群体水平上研究微生物的形态构造、生理代谢、遗传变 异、生态分布和分类进化等生命活动基本规律,并将其应用于工业发酵、医药卫生、生物工程和环境保护等 实践领域的科学。 四、 微生物与人类 微生物无处不在,我们无时不生活在“微生物的海洋”中。 (一)微生物对人类的危害 疾病: 1347 年,鼠疫杆菌(Yersinia pestis)引起的瘟疫几乎摧毁了整个欧洲,有 1/3 的人(约 2500 万人)死 于这场灾难。 1843—1847 年,欧洲人主要粮食马铃薯得病,饿死了 100 万人,164 万人逃往北美。 新的瘟疫: ①艾滋病(AIDS)正在全球蔓延。

2002 年,全球艾滋病人达 6000 万,我国 100 万。 许多已被人类征服的传染病又有"卷土重来 "之势。 如肺结核、虐疾、霍乱等。目前全世界有 18.6 亿人患结核病,相当于全球人口的 32 %。 环境污染的日益严重,一些新的疾病又给人类带来新的威胁。 ②军团病 ③埃博拉病毒病 ④霍乱新菌型 0139 ⑤埃希氏大肠杆菌 0157 ⑥疯牛病 2. 霉腐

粮食、木材、纸张、衣物、光学器材和电子元件等 3. 堵塞管道,破坏地下建筑

(二) 微生物对人类的贡献 1. 生产食品和食品添加剂 例如:面包、酱油、醋、味精、奶酪、酒和泡菜 2. 生产医药产品 各种抗生素、维生素、生长激素和疫苗等 3. 生产轻工、化工、 农用产品 氨基酸、有机酸、酶制剂、农药和有机溶剂 4. 修复环境 肥沃土壤 Eg.固氮菌,净化污水 5. 物质循环、再生资源 有机物 有生命状态 新材料: ①生物塑料 ②纳米材料 ③微电子材料——银晶体 ④磁性材料 ⑤液晶材料 ⑥耐高压材料 ⑦生物计算机 ⑧生物计算机:用生物大分子作元件的计算机 无机物 无生命状态

6.生物能源 ①酒精 ②沼气 ③氢气 ④微生物电池 ⑤藻类生产燃料 7. 理论研究的对象 ①理想材料 ②遗传工程的研究 ③高等动植物的研究 8. 生物工程的主角 基因工程为代表的现代生物技术

第二节 一、初创时期(形态学时期)

微生物学的发展史

1664 年,英国人虎克(Robert Hooke)用显微镜观察微生物。虎克曾用原始的显微镜对生长在皮革表面 及蔷薇枯叶上的霉菌进行观察。 1674~1695 年,荷兰人列文虎克制造分辨率大的单式显微镜; 1676 年,微生物学的先驱荷兰人列文虎克(Antony van leeuwenhoek)首次观察到了细菌。他没有上过大 学,是一个只会荷兰语的小商人,但却在 1680 年被选为英国皇家学会的会员。 二、奠基时期(生理学时期) 1. 巴斯德 微生物学之父 (1) 发现并证实发酵是由微生物引起的。 化学家出生的巴斯德涉足微生物学是为了治疗“酒病”和“蚕病”。 (2) 彻底否定了“自然发生”学说 著名的曲颈瓶试验无可辩驳地证实,空气内确实含有微生物,是它们引起有机质的腐败。 (3) 免疫学——预防接种 首次制成狂犬疫苗 (4) 其他贡献 巴斯德消毒法:60~65℃作短时间加热处理,杀死有害微生物。 2. 柯赫 细菌学的奠基人

(1) 微生物学基本操作技术方面的贡献 a)细菌纯培养方法的建立(纯种分离技术)

b)悬浮培养法 c)流动蒸汽灭菌 d)细胞染色技术和显微摄影 三、发展时期(生化时期) 无活细胞酵母压榨液 葡萄糖、酒精 1. 青霉素 英国微生物学家弗来明发现青霉素,开创了用抗生素治疗疾病的新纪元。 2. 摇瓶培养技术 四、分子生物学时期(成熟时期)

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教 307 第一章 原核微生物的形态构造和功能 细菌(Bacteria)

第一节

细菌是一类细胞细短、结构简单、胞壁坚韧、多以二分裂方式繁殖和水生性较强的原核生物。 一、基本形态:球状、杆状、螺旋状 1. 球菌 细胞个体呈球形或椭圆形, 不同种的球菌在细胞分裂时会形成不同的空间排列方式, 常被作为分类依据。 单球菌、双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌 金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片,淋病奈瑟氏球菌,肺炎双球菌 2. 杆菌 细胞呈杆状或圆柱形,一般其粗细(直径)比较稳定,而长度则常因培养时间、培养条件不同而有较大 变化。 枯草芽孢杆菌 铜绿假单胞菌(绿脓杆菌) 结核分枝杆菌 炭疽杆菌 破伤风梭菌 鼠疫巴斯德氏菌 杆状细菌的排列方式常因生长阶段和培养条件而发生变化,一般不作为分类依据。3. 螺旋菌 螺旋菌按其弯曲的程度可分为:

弧菌:菌体只有一个弯曲,其程度不足一圈,形似“C”字或逗号,鞭毛偏端生。霍乱弧菌 (寄生性弧 菌-----蛭弧菌)螺旋菌:菌体回转如螺旋,螺旋数目和螺距大小因种而异。鞭毛二端生。细胞壁坚韧,菌体 较硬。 螺旋体:菌体柔软,无鞭毛,用于运动的类似鞭毛的轴丝位于细胞外鞘内。大多数是致病菌。 4. 特殊形态 1) 柄杆菌(prosthecate bacteria)细胞上有柄(stalk) 2) 星形细菌(star-shaped bacteria ) 3) 方形细菌(square-ahaped bacteria) 4) 异常形态环境条件的变化 物理、化学因子的刺激 培养时间过长 细胞衰老 阻碍细胞正常发育

自身代谢产物积累过多 环境条件恢复正常形态 二、细菌的大小 细胞大小表示:宽×长单位:微米最小的细菌——与无细胞结构的病毒相仿(50 nm) 最大的细菌——肉眼可见(0.75 mm)费氏刺骨鱼菌(0.08 mm x 0.6 mm)(Epulopiscium fishelsoni)比 大肠杆菌大 100 万倍(1985 年发现) 德国科学家 H. N. Schulz 等 1999 年在纳米比亚海岸的海底沉积物中发现的一种硫磺细菌(sulfur bacterium) ,其大小可达 0.75 mm,Thiomargarita namibiensis,---------“纳米比亚硫磺珍珠”一般细 菌的大小范围: 0.5 ~ 1 mm (直径) 0.2~ 1 mm (直径) X 1~ 80 mm(长度)0.3~ 1 mm (直径) X 1~ 50 mm(长度) (长度是菌体两端点之间的距离,而非实际长度)三、细菌细胞的结构 一般构造:一般细菌都有的构造。 特殊构造:部分细菌具有的或一般细菌在特殊环境下才有的构造。 1.细胞壁 1)概念:细胞壁(cell wall)是位于细胞表面,内侧紧贴细胞膜的一层较为坚韧,略具弹性 的细胞结构。 2)证实细胞壁存在的方法: (1)细菌超薄切片的电镜直接观察; (2)质、壁分离与适当的染色,可以在光学显微镜下看到细胞壁; (3)机械法破裂细胞后,分离得到纯的细胞壁; (4)制备原生质体,观察细胞形态的变化; 3)细胞壁的功能: (1)固定细胞外形和提高机械强度(2)为细胞的生长、分裂和鞭毛运动所必需(3) 渗透屏障,阻拦酶蛋白和某些抗生素等大分子物质(分子量大于 800)进入细胞,保护细胞免受溶菌酶、消

化酶和青霉素等有害物质的损伤(4)细菌特定的抗原性、致病性以及对抗生素和噬菌体的敏感性的物质基 础 4)革兰氏染色与细胞壁:C.Gram(革兰)于 1884 年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。 1、用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染;2、用碘溶液进行媒染,其作用是提高染料和细胞间的相互 作用从而使二者结合得更牢固;3、用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。在经历脱色后仍将结晶紫保留在细胞内的 为革兰氏阳性细菌,而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉,细胞呈无色;4、用一种与结晶紫具有不同颜色的 碱性染料对涂片进行复染。例如沙黄,它使原来无色的革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色,而革兰氏阳性 细菌继续保持深紫色。 4)革兰氏阳性和阴性细菌的比较革兰氏染色的原理 (2)革兰氏阳性细菌的细胞壁特点:厚度大(20~80nm)化学组分简单,一般只含 90%肽聚糖和 10%磷 壁酸 A、肽聚糖 厚约 20~80nm,由 40 层左右的网格状分子交织成的网套覆盖在整个细胞上。原核生物所

特有的已糖双糖单位双糖单位中的β -1,4-糖苷键很容易被溶菌酶(lysozyme)所水解,从而引起细菌因肽聚 糖细胞壁的“散架”而死亡。由四个氨基酸分子按 L 型与 D 型交替方式连接而成。目前所知的肽聚糖已超过 100 种,在这一“肽聚糖的多样性”中,主要的变化发生在肽桥上。 B、磷壁酸 革兰氏阳性细菌细胞壁上特有的化学成分,主要成分为甘油磷酸或核糖醇磷酸。主要生理

功能:细胞壁形成负电荷环境,增强细胞膜对二价阳离子的吸收;贮藏磷元素;增强致病性。二价阳离子, 特别是高浓度的 Mg2+。的存在,对于保持膜的硬度,提高细胞膜上需 Mg2+的合成酶的活性极为重要。 可作为细菌分类、鉴定的依据革兰氏阳性细菌特异表面抗原的物质基础;噬菌体的特异性吸附受体;防 止细胞因自溶而死亡。 C、外膜蛋白(outer membrane protein) 3、 细胞质和内含物 1)概念:细胞质(cytoplasm)是细胞质膜包围的除核区外的一切半透明、胶状、颗粒状物质的总称。 含水量约 80%。 细胞质的主要成分为核糖体、贮藏物、多种酶类和中间代谢物、质粒、各种营养物和大分子的单体等, 少数细菌还有类囊体、羧酶体、气泡或伴孢晶体等 2)颗粒状贮藏物(reserve materials): 贮藏物是一类由不同化学成分累积而成的不溶性沉淀颗粒,主要功能是贮存营养物。 糖原:碳源及能源类 聚β -羟丁酸(PHB) : 硫粒: 贮藏物藻青素: 藻青蛋白:

磷源(异染粒) : 类脂性质的碳源类贮藏物 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)在含乙酸或丁酸的培养基中生长时,细胞内贮藏的 PHB 可达其 干重的 60%。 PHB 于 1929 年被发现,至今已发现 60 属以上的细菌能合成并贮藏。它无毒、可塑、易降解,被认为是 生产医用塑料、生物降解塑料的良好原料。 微生物储藏物的特点及生理功能: 不同微生物其储藏性内含物不同 微生物合理利用营养物质的一种调节方式 储藏物以多聚体的形式存在,有利于维持细胞内环境的平衡, 避免不适合的 pH,渗透压等的危害。 储藏物在细菌细胞中大量积累,还可以被人们利用。 3)磁小体(megnetosome) 趋磁细菌细胞中含有的大小均匀、数目不等的 Fe3O4 颗粒,外有一层磷脂、蛋白或糖蛋白膜包裹。 功能是导向作用,即借鞭毛游向对该菌最有利的泥、水界面微氧环境处生活。实用前景,包括生产磁性 定向药物或抗体,以及制造生物传感器等 5)气泡(gas vocuoles) 气泡的膜只含蛋白质而无磷脂。二种蛋白质相互交连,形成一个坚硬的结构,可耐受一定的压力。膜的 外表面亲水,而内侧绝对疏水,故气泡只能透气而不能透过水和溶质。 6)载色体(Chromatophore) 光和细菌进行光和作用的部位相当于绿色植物的叶绿体 7)核糖体(ribosome) 8)质粒(plasmid) 4、核区(nuclear region or area)细菌的细胞核是一个拟核(nucleoid) ,实际上是一条环状的裸露 的 DNA 链,所以也称染色质体(chromatinic body)或细菌染色体(bacterial chromosome) 。无核膜结构、 无固定形态。观察:现代同位素放射性显影术、重金属投影术、电镜。 核区是一个反差极弱的区域,没有核膜,内含丝状物,即 DNA 分子。 用富尔根(Feulgen)染色法或姬姆萨(Giemsa)染色法,在普通光学显微镜下可看到核区。 静止期的细菌,其核呈球形、棒状或哑铃状,在正常情况下,一个菌体细胞里只有一个核;而细胞生长 旺盛时,DNA 复制先于分裂,则细胞里会含有 2~4 个核。 在细胞分裂时,核呈 H、X 和 Y 形。 无核膜结构、无固定形态的原始核

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5、细菌细胞壁以外的构造 ——— 糖被(glycocalyx) 1)概念 包被于某些细菌细胞壁外的一层厚度不定的胶状物质。糖被按其有无固定层次、层次厚薄又可细分为荚 膜 (capsule 或 macrocapsule, 大荚膜) 微荚膜(microcapsule)、 、 粘液层(slime layer)、 菌胶团(zoogloea)。 粘液层 荚膜 菌胶团 2)特点 (1)主要成分是多糖、多肽或蛋白质,尤以多糖居多。经特殊的荚膜染色,特别是负染色(又称背景 染色)后可在光学显微镜清楚地观察到它的存在。 (2)产生糖被是微生物的一种遗传特性,其菌落特征及血清学反应是是细菌分类鉴定的指标之一。 (3)荚膜等并非细胞生活的必要结构,但它对细菌在环境中的生存有利。 (4)细菌糖被与人类的科学研究和生产实践有密切的关系。 (详见 P58) 6、细菌细胞壁以外的构造 ——— 鞭毛(flagellum,复 flagella) 1)概念 某些细菌细胞表面着生的一至数十条长丝状、螺旋形的附属物,具有推动细菌运动功能,为细菌的“运 动器官”。 单端鞭毛 端生丛毛 两端生鞭毛 周生鞭毛 鞭毛的有无和着生方式具有十分重要的分类学意义。 2)观察和判断细菌鞭毛的方法 ?电子显微镜直接观察 ?光学显微镜下观察:鞭毛染色和暗视野显微镜 ?根据培养特征判断:半固体穿刺、菌落(菌苔)形态 3)鞭毛的结构及其运动机制 4)鞭毛推动细菌运动的特点 (1)速度 (参见 P59)

一般速度在每秒 20~80μ m 范围,最高达每秒 100μ m(每分钟达到 3000 倍体长) ,超过了陆上跑得最快 的动物——猎豹的速度(每分钟 1500 倍体长或每小时 110 公里) 。 (2)细菌以推进方式做直线运动,以翻腾形式做短促转向运动。 (3)细菌的趋避运动 鞭毛的功能是运动,这是原核生物实现趋向性的有效方式。化学趋避运动或趋化作用(chemotaxis) : 细菌对某化学物质敏感,通过运动聚集于该物质的高浓度区域或低浓度区域。 光趋避运动或趋光性(phototaxis) :有的细菌能区别不同波长的光而集中在一定波长光区内。 趋磁运动或趋磁性(magnetotaxis) ,趋磁细菌根据磁场方向进行分布。 7、细菌细胞壁以外的构造 ——— 菌毛(fimbria,复数 fimbriae) 长在细菌体表的纤细、中空、短直、数量较多的蛋白质类附属物,具有使菌体附着于物体表面的功能。 每个细菌约有 250~300 条菌毛。有菌毛的细菌一般以革兰氏阴性致病菌居多,借助菌毛可把它们牢固 地粘附于宿主的呼吸道、消化道、泌尿生殖道等的粘膜上,进一步定植和致病。 8、细菌细胞壁以外的构造 ———性毛(pili,单数 pilus) 构造和成分与菌毛相同,但比菌毛长,数量仅一至少数几根。 性毛一般见于 G+的雄性菌株(即供体菌)中,其功能是向雌性菌株(即受体菌)传递遗传物质。有的性 毛还是 RNA 噬菌体的特异性吸附受体。 9、 特殊的休眠构造——芽孢 1)概念 某些细菌在其生长发育后期,在细胞内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休眠 体,称为芽孢(endospore 或 spore,偶译“内生孢子”) 。 2)细菌芽孢的特点 整个生物界中抗逆性最强的生命体,消灭芽孢是衡量各种消毒灭菌手段的最重要的指标。芽孢是细菌的 休眠体,在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞;产芽孢细菌的保藏多用其芽孢。 产芽孢的细菌多为杆菌,也有一些球菌。芽孢的有无、形态、大小和着生位置是细菌分类和鉴定中的重 要指标。 芽孢与营养细胞相比化学组成存在较大差异,容易在光学显微镜下观察。 (相差显微镜直接观察;芽孢 染色) 3)芽孢的结构 芽孢是一个多层结构: 最里面是核心,即我们书上所说的核区。 芽胞质 内膜——芽胞膜

初生的细胞壁——芽胞壁 皮层 外膜 孢子衣 外壳层 外孢子囊——孢外壁 4)芽孢的形成与芽孢的萌发过程 (1)轴丝的形成 (2)隔膜的形成 (3)前孢子的形成 (4)皮层形成 (5)孢子衣的形成 (6)芽孢形成 5)芽孢的萌发 在条件具备的情况下,芽孢萌发的必要条件:水、营养物、温度和 O2,芽孢在几分钟内便可萌发,芽孢 吸收了水和营养物,体积膨大,皮层破裂,长出芽管,发育成新的营养细胞,与此同时芽孢的特征消失。 特殊的休眠构造——芽孢 (参见 P53-54)芽孢的形成与芽孢的萌发过程

伴孢晶体(parasporal crystal) 少数芽孢杆菌,例如苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)在其形成芽孢的同时,会在芽孢旁形成一颗 菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体——δ 内毒素,称为伴孢晶体。特点:不溶于水,对蛋白酶类不敏感;容易 溶于碱性溶剂。 6)伴孢晶体(parasporal crystal) 伴孢晶体对 200 多种昆虫尤其是鳞翅目的幼虫有毒杀作用——细菌杀虫剂。 伴孢晶体鳞翅目幼虫口服伴孢晶体在肠道迅速溶解(中肠 pH 为 9.0-10.5) 吸附于上皮细胞,引起渗透性丧失,肠道穿孔肠道中的碱性溶液进入血液,后者 pH 升高,昆虫全身麻 痹而死亡。 四、细菌的繁殖繁殖方式 裂 殖: 二分裂 三分裂 复分裂 芽 殖 1.裂 殖(fission)一个细胞通过分裂而形成两个子细胞的过程。

杆状细胞 橫分裂:分裂时细胞间形成的隔膜与细胞长轴呈垂直状态。 纵分裂:分裂时细胞间形成的隔膜与细胞长轴呈平行状态。 (1)二分裂(binary fission) 对称的二分裂:一个细胞在其对称中心形成一隔膜,进而分裂成两个形态、大小和构造完全相同的子细 胞。 不等二分裂:分裂成两个在外形、构造上有明显差别的子细胞。 (2)三分裂(trinary fission) 部分细胞进行成对的“一分为三”方式的三分裂,形成一对“Y”形细胞,随后仍进行二分裂,其结果 就形成了特殊的网眼状菌丝体。 2. 芽 殖(budding)指在母细胞表面(尤其在其一端)先形成一个小突起,待其长大到与母细胞相仿 后再相互分离并独立生活的一种繁殖方式。 凡以这类方式繁殖的细菌,通称为——芽生细菌(budding bacteria) 。 五、细菌的群体形态 1. 在固体培养基上(内)的群体形态 (1)菌落 菌落是指在固体培养基上(内)以母细胞为中心的一堆肉眼可见的,有一定形态、构造等特征的子细胞 集团。 如果菌落是由一个单细胞繁殖形成的, 则它就是一个纯种细胞群或克隆 (clone) (bacterial lawn) 菌苔 : “菌落”已互相连成一片,这就是~。 (2)细菌菌落的特征 主要特征:一般呈现为湿润、较光滑、较透明、较粘稠、易挑取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中 央部位颜色一致等。 细菌的菌落特征因种而异! 同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落六、发酵工业中常用常见的细菌 1. 肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) 细胞球形,双凸镜状,短链排列。 2. 蔗糖经肠膜状明串珠菌发酵后生成高分子葡萄糖复合物,经处理精制而得成品即为医药临床用的右 旋糖酐 6%的葡聚糖溶液的粘度,渗透后及胶体渗透后约等于血液的值,可以做代血浆。 葡聚糖能被机体很快的吸收,与铁的化合物可用于治疗贫血。 高分量的葡聚糖在食品工业中可作增稠剂。 3. 枯草芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌可用于淀粉酶的生产;

枯草芽孢杆菌可用于蛋白酶的生产; eg. 加酶洗衣粉,饲料添加剂 4. 醋酸杆菌醋厂用醋酸杆菌生产醋,形成醋酸的速度较许氏醋酸杆菌,但这种菌能提供极好的香气, 是代谢的副产物——乙酸乙酯。 但这种菌可把醋酸进一步氧化成 CO2 和水,所以醋酸形成后要及时杀死该菌。 5. 德氏乳酸杆菌是生产乳酸的重要菌种,杆菌,无鞭毛,无芽孢,营养要求高,需要多种生长因子, 厌 O2。 温度要求:在 50~52℃生长,最适生长温度 40~44℃ 。 pH 要求:乳酸发酵过程中 pH 必须控制在 5.5~6.0,为防止 pH 下降,发酵过程中用 CaCO3 中和乳酸—— 乳酸钙。 6. 乳链球菌是于 1878 年 Lister 获得的第一个纯的乳酸菌。 发酵葡萄糖产生乳酸,是乳制品工业和传统食品工业中常用菌。 7. 丙酮丁醇梭菌细胞杆状,芽孢圆,位于细胞中央或次端,芽孢囊膨大呈梭状或鼓锤状。能够直接利 用玉米等含淀粉的原料发酵生产丙酮丁醇。 8. 北京棒杆菌细胞为短杆状,呈“八”字排列,G+,无芽孢。此菌是味精——谷氨酸钠盐的生产菌, 发酵以大米、尿素为原料,谷氨酸钠的产量与生物素关系很大。 9. 产氨短杆菌该菌在氨基酸、核苷酸工业中为主要生产菌,产氨短杆菌不同的菌株可用于发酵生产次 黄嘌呤、5‘-肌甘酸、 5‘-磷酸核糖焦磷酸。 10. 大肠杆菌短杆菌,G-,周身鞭毛,无芽孢,菌落黄白色,能发酵乳糖产生大量的有机酸和 CO2。

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教 307 第二节 放线菌(Actinomyces)

放线菌是 1877 年合兹首先在牛体内发现的。在形态上具有分枝状菌丝、菌落形态与霉菌相似,以孢子 进行繁殖。“介于细菌与丝状真菌之间又接近细菌的一类丝状原核生物”放线菌实际上是属于细菌范畴内的 原核微生物,只不过其细胞形态为分枝状菌丝。 放线菌:是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强的原核生物。也可将之定义为一类主要呈 丝状生长和以孢子繁殖的 G+细菌。 一、放线菌的分布 放线菌广泛分布在含水量较低、有机物较丰富和呈微碱性的土壤中。 1 克土壤中可存在数万~数百万个孢子。 一般, 肥沃土 > 贫瘠土

农田 > 森林 中性偏碱土壤 > 酸性土壤 含水低土 > 含水高土 二、放线菌与人类的关系 1.多数属于有益菌 (1)腐生型放线菌在自然界物质循环中起很重要的作用。 (2)生产抗生素的主要微生物 据估计,全世界近万种抗生素约 70%是放线菌的次生代谢产物。 (3)筛选到许多新的生化药物 Eg.抗癌剂、酶抑制剂、抗寄生虫剂、免疫抑制剂和农用杀虫(杀菌)剂等。 (4)是许多酶、维生素等的产生菌 (5)Frankia(弗兰克氏菌属)对非豆科植物的共生固氮具有重大作用。 (6)在甾体转化、石油脱蜡、烃类发酵、污水处理等方面也有应用 (7)具有极强的分解纤维素、石蜡、角蛋白、琼脂和橡胶等的能力,故它们在环境保护、提高土壤肥 力和自然界物质循环中起着重大作用。 2.危害 (1)寄生型的放线菌可引起人、动物和植物的许多疾病,eg.肺部感染、皮肤病、脑膜炎(2)具有特 殊的土腥味(土霉素的味道) ,主要由放线菌产生的土腥味素所引起的。可使水、食品变味,也能破环棉毛 织品、纸张等。 三、放线菌的形态与构造 ?单细胞,大多由分枝发达的菌丝组成; ?菌丝直径与杆菌类似,约 1?m; ?细胞壁组成与细菌类似,革兰氏染色阳性(少数阴性) ; ?细胞的结构与细菌基本相同,按形态和功能可分为营养菌丝、气生菌丝和孢子丝三种。 4. 孢子 孢子丝生长到一定阶段,形成一串孢子,成熟后孢子就单个释放,孢子的形状、颜色和孢子表面状况等 也是菌种鉴定的重要依据。 四、放线菌生长与繁殖 1 .放线菌的生活史 五、放线菌的繁殖繁殖方式 无性孢子 分生孢子 孢囊孢子

菌丝断裂 细菌的芽孢是休眠体,而放线菌的孢子是繁殖体 六、放线菌菌落形态 菌落形态,能产生大量分枝和气生菌丝的菌种(如链霉菌)菌落质地致密,与培养基结合紧密,小而不 蔓延,不易挑起或挑起后不易破碎。不能产生大量菌丝体的菌种(如诺卡氏菌)粘着力差,粉质,针挑起易 粉碎。 第三节 蓝细菌(Cyanobacteria) 1、概念 也称蓝藻或蓝绿藻(blue-green algae) ,是一类含有叶绿素 a、能以水作为供氢体和电子供体、通过光 合作用将光能转变成化学能、同化 CO2 为有机物质的光合细菌。 以前曾归于藻类,因为它和高等植物一样具有光和色素----叶绿素 a,能进行产氧型光合作用。 6. 蓝细菌与人类的关系 (1)重大的经济价值 ① 具有固氮能力,是良好的绿肥 Eg.满江红鱼腥蓝细菌(Anabaena azollae) ② 食用种类 Eg.发菜念珠蓝细菌(Nostoc flagelliforme) 普通木耳念珠蓝细菌(N.commune or 葛仙米、地耳) 盘状螺旋蓝细菌(Spirulina platensis) 最大螺旋蓝细菌(S.maxima) (2)危害 ① 海水“赤潮”和湖泊“水华”的元凶,给渔业和养殖业带来严重危害。 ② 少数种类可产生诱发人类肝癌的毒素 Eg.微囊蓝细菌属(Microcystis)

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教 203 第四节 支原体、立克次氏体和衣原体

一、支原体(Mycoplasma) 1.概念 支原体,又称类菌质体,是一类无细胞壁、介于独立生活和细胞内寄生生活之间的最小型原核生物。多 数为致病菌。 支原体:人或动物的致病菌 类支原体(MLO) :侵染植物的支原体

2.特性 1)无细胞壁,只有细胞膜,细胞形态多变; 2)个体很小,能通过细菌过滤器,曾被认为是最小的可独立生活的细胞型生物。 3)可进行人工培养,但营养要求苛刻,菌落微小,呈典型的 “油煎荷包蛋”形状; 球状体:0.2-0.25 ?m,最小达 0.1 ?m;丝状体最长可达 150 ?m,因细胞柔软且具扭曲性,致使细 胞能通过孔径比自身小得多的过滤器。 4)一些支原体能引起人类、牲畜、家禽和作物的病害疾病 5)应用活组织细胞培养病毒或体外组织细胞培养时,常被支原体污染; 二、立克次氏体(Rickettsia) 1.概 念 立克次氏体,是大小介于通常的细菌与病毒之间,在许多方面类似细菌,专性活细胞内寄生的原核微生 物。 立克次氏体:专性寄生于真核细胞内 G-原核生物 类立克次氏体细菌(RLB) :侵染植物的立克次氏体 H.T.Ricketts 1909 年,首次发现洛杉矶斑疹伤寒的病原体,并因研究此病而牺牲,1916 年人们以他的 名字命名这类病原体作为纪念。 2. 特 性 (1)某些性质与病毒相近 专性活细胞寄生物,除五日热(战壕热)立克次氏体(Rickettsia wolhynica)外均不能在人工培养基 上生长繁殖。 ?体内酶系不完全,一些必需的养料需从宿主细胞获得; ?细胞膜比一般细菌的膜疏松;可透性膜,使它们有可能容易从宿主细胞获得大分子物质,但也决定了 它们一旦离开宿主细胞则易死亡 大小介于病毒与一般细菌之间,其中伯氏立克次氏体(Rickettsia burneti)能通过细菌过滤器 一般个体:球状体:0.2-0.5 ?m;杆状体:0.3-0.5 x 0.3-2 ?m; (2)从一种宿主传至另一宿主的特殊生活方式 主要以节肢动物(虱、蜱、螨等)为媒介,寄生在它们的消化道表皮细胞中,然后通过节肢动物叮咬和 排泄物传播给人和其他动物。 有的立克次氏体酿成严重疾病,如人类的流行性斑疹伤寒、恙虫热、Q 热等,并常伴随着灾害、战争和 饥饿,曾长期与人类的痛苦、灾难联系在一起。 防治:预防为主。 三、衣原体(Chlamydia) 1.概念

衣原体,介于立克次氏体与病毒之间,能通过细菌滤器,专性活细胞内寄生的一类原核微生物。 过去误认为“大病毒”,但它们的生物学特性更接近细菌而不同于病毒。在宿主细胞内观察到的衣原体 微菌落(microcolony) 2.特性 (1)细胞结构与细菌类似;具有类似的细胞壁,细胞壁内也含有胞壁酸、二氨基庚二酸;70S 核糖体也 是由 30S 和 50S 二个亚基组成) (2)细胞呈球形或椭圆形,直径 0.2-0.3 ?m,能通过细菌滤器; (3)专性活细胞内寄生;衣原体有一定的代谢活性,能进行有限的大分子合成,但缺乏产生能量的系 统,必须依赖宿主获得 ATP,因此又被称为“能量寄生型生物”。 (5)衣原体广泛寄生于人类、哺乳动物及鸟类,少数致病;沙眼衣原体是人类砂眼的病原体,甚至引 起结膜炎、角膜炎、角膜血管翳等临床症状,成为致盲的重要原因。 1956 年, 我国微生物学家汤飞凡等应用鸡胚卵黄囊接种法, 在国际上首先成功地分离培养出沙眼衣原体。 (6)衣原体不耐热,60 度 10 分钟即被灭活,但它不怕低温,冷冻干燥可保藏多年。对红霉素、氯霉素、 四环素敏感。

本章小结 1. 原核生物可粗分为“三菌”和“三体”6 个大类。

三菌:细菌(含古生菌) ,放线菌,蓝细菌 三体:支原体,立克次氏体,衣原体 共同特点:个体微小、形态简单、进化地位低,基因组为原核状态 2. 原核生物的共同特征

细胞细小、核的结构原始,无核膜包裹,细胞壁含独特的肽聚糖,细胞内无细胞器分化。 3. 原核细胞的共同结构和特殊构造 共同结构 细胞壁(支原体例外) 细胞质膜 细胞质 核区 各种内含物等 复习思考题 特殊构造 糖被(荚膜、粘液层) 鞭毛 菌毛 芽孢等

1.设计一张表格,比较一下 6 个大类原核生物的主要特性。 2. 试图示 G+和 G-细菌细胞壁的主要构造,并简要说明其异同。 3. 试述革兰氏染色法的机制并说明此法的重要性 4. 什么是菌落?试讨论细菌的细胞形态与菌落形态间的相关性。

第二章

真核微生物的形态构造和功能

真核微生物(eukaryotic micro-organisms):是一大类细胞核具有核膜,能进行有丝分裂,细胞质中 存在线粒体或同时存在叶绿体等多种细胞器的微生物。 真菌、显微藻类和原生动物等是属于真核微生物。 我们的重点是真菌,真菌包括酵母、霉菌和蕈菌。 真核生物与原核生物的比较: 比较项目 细胞大小 真核生物 较大(通常直径>2 mm ) 原核生物 较小(通常直径<2mm )

若有壁,其主要成分

纤维素、几丁质等

多数为肽聚糖

细胞膜中甾醇 细胞膜含呼吸或光



无(仅支原体例外)

无 合成分 细胞器 有





鞭毛结构

如有,则粗而复杂

如有,则细而简单

核膜 DNA 含量 细胞核 组蛋白 核仁 染色体数

有 低(约 5%) 有 有 一般>1

无 高(约 10%) 无 无 一般为 1

有丝分裂 减数分裂

有 有

无 无

氧化磷酸化部位 光合作用部位 生理特 生物固氮能力 性 专性厌氧生活 化能合成作用 鞭毛运动方式

线粒体 叶绿体 无 罕见 无 挥鞭式 有性生殖、

细胞膜 细胞膜 有些有 常见 有些有 旋转马达式 转化、转导、 接合等 一般为无性(二等分

遗传重组方式 准性生殖等 繁殖方式 有性、无性等多种 裂)

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教 307 第一节 酵母菌(Yeast)

酵母菌:泛指能发酵糖类的各种单细胞的真菌。 5 个特点: (1)个体一般以单细胞状态存在 (2)多数营出芽繁殖 (3)能发酵糖类产能 (4)细胞壁常含甘露聚糖 (5)常生活在含糖量较高、酸度较大的水生环境中 一、分布及与人类的关系 1. 多分布在含糖的偏酸性环境,也称为“糖菌”

如水果、蔬菜、叶子、树皮等处,及葡萄园和果园土壤中等。 有的酵母菌可利用烃类物质 如:假丝酵母、毕赤式酵母是正烷烃发酵生产二羧酸的高产微生物。 为石油化工开发出许多崭新的工艺过程和生产出许多用化学合成所不能生产的新产品。 2. 重要的微生物资源 酵母菌是人类的第一种“家养微生物” 酿造工业:酒类的生产、果汁发酵 食品工业:面包、馒头的制作 医药工业:核苷酸、CoA、细胞色素 C、凝血质和维生素等生化药物和试剂 饲料工业:单细胞蛋白(SCP) ---“人造肉” 化学工业:有机酸、酒精、脂肪酸和甘油等 3. 重要的科研模式微生物 啤酒酵母(Saccharomyces cerevisae)第一个完成全基因组序列测定的真核生物(1996) 表达外源蛋白功能的优良“工程菌”---真核微生物 4. 有些酵母菌具有危害性 有些酵母菌能引起皮肤、呼吸道、消化道、泌尿生殖道疾病。 白假丝酵母(Candida albicans)白色念珠菌 新型隐球菌(Cryptococcus neoformans) 引起鹅口疮、阴道炎或肺炎等疾病 二、酵母菌的形态和大小 酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、圆柱、梨形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。其细胞直 径一般是细菌的 10 倍左右。酵母菌无鞭毛,不能游动。 三、细胞结构 1. 荚有些酵母(例如:隐球酵母菌属)其细胞壁外还有一层类似细菌荚膜的多糖物质。膜物质 2. 细胞核 酵母菌具有由多孔核膜包裹起来的定形细胞核。 酵母菌细胞核是其遗传信息的主要贮存库 Eg.啤酒酵母(Saccharomyces cerevisae)基因组共有 17 条染色体,6500 个基因。 除细胞核含 DNA 外,在酵母菌线粒体、“2mm 质粒”及少数酵母菌线状质粒中也含有 DNA。 2mm 质粒:一个闭合环状超螺旋 DNA 分子,用于研究基因调控、染色体复制的理想系统,也可作为酵母 菌转化的有效载体,并由此组建“工程菌”。 3. 微丝 (Fimbriae) ? 化学成分:蛋白质

?

功能:细胞凝聚

四、酵母菌繁殖方式和生活史 酵母菌的繁殖方式多样,分为无性繁殖和有性繁殖 假酵母(拟酵母) :只进行无性繁殖的酵母菌 真酵母:具有有性繁殖的酵母菌 (一) 无性繁殖 1.芽殖(budding) 主要的无性繁殖方式,成熟细胞长出一个小芽,到一定程度后脱离母体继续长成新个体。

酵母菌的出芽方式

子细胞的形态

多边出芽

圆形、椭圆或柱状

两边出芽

柠檬形

三边出芽 2. 裂殖(fission)

三角形

少数酵母菌可以象细菌一样借细胞横割分裂而繁殖,例如裂殖酵母。 3. 无性孢子 节孢子 掷孢子 厚垣孢子 (二) 有性繁殖 3. 核配,形成二倍体核的接合子: ? ? 单倍体:细胞中只有一套染色体 双倍体:细胞中含有二套染色体

酵母菌以形成子囊和子囊孢子的形式进行有性繁殖: 1. 两个性别不同的单倍体细胞靠近,相互接触; 2. 接触处细胞壁消失,质配 3. 核配,形成二倍体核的接合子 A、以二倍体方式进行营养细胞生长繁殖,独立生活; 下次有性繁殖前进行减数分裂。 B、进行减数分裂,形成 4 个或 8 个子囊孢子,而原有的营养

细胞就成为子囊。子囊孢子萌发形成单倍体营养细胞 (三) 酵母菌的生活史 生活史又称生命周期:指上一代生物个体经一系列生长、发育阶段而产生下一代个体的全部过程。 酵母生活史按其单倍体生长时间的长短分三类: 1. 营养体既能以单倍体也能以二倍体形式存在 典型代表:酿酒酵母 特点: (1)一般情况下都以营养体状态进行出芽繁殖 (2)营养体既能以单倍体(n)形式存在,也能以二倍体(2n)形式存在 (3)在特定的条件下进行有性繁殖 2. 营养体只能以单倍体形式存在 (核配后立即进行减数分裂) 典型代表:八孢裂殖酵母 特点: (1)营养细胞为单倍体 (2)无性繁殖为裂殖 (3)二倍体细胞不能独立生活,故此期极短 3. 营养体只能以二倍体形式存在 (核配后不立即进行减数分裂) 典型代表:路德类酵母 特点: (1)营养体为二倍体,不断进行芽殖,此阶段较长 (2)单倍体的子囊孢子在子囊内发生接合 (3)单倍体阶段仅以子囊孢子的形式存在,不能进行独立生活 五、酵母菌的菌落 与细菌菌落类似,但一般较细菌菌落大且厚,表面湿润、透明、光滑、易被挑起,多为乳白色,少数呈 红色。 六、工业上比较常用的酵母菌 酿酒酵母:酒、面包、谷胱甘肽、ATP 粘红酵母粉红变种:脂肪含量达细胞干重的 50-60% Met 含量达细胞干重的 1% 白地霉、热带假丝酵母:单细胞蛋白 棉病针孢酵母、无名假丝酵母:VB2

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教 203 第二节 霉菌(Mold)

霉菌是丝状真菌的一个俗称,意即“会引起物品霉变的真菌”,通常指那些菌丝体较发达又不产生大型 柔质子实体结构的真菌。 一、分布及与人类的关系 1. 在自然界分布极广 霉菌同人类的生产、生活关系密切,是人类实践活动中最早认识和利用的一类微生物。 2. 食物、工农业制品的霉变 全世界平均每年由于霉变而不能食(饲)用的谷物约占 2%。 英国每年由于霉变木材损失 3-4 亿美元 食品、纺织品、皮革、木材、纸张、光学仪器、电工器材和照相材料等发霉。 3. 生产的产品 风味食品:酱、酱油、腐乳、酒 抗生素:青霉素、灰黄霉素 有机酸:柠檬酸、葡萄糖酸、延胡索酸等 酶制剂:淀粉酶、果胶酶、纤维素酶等 维生素:甾体激素等 农用产品:饲料添加剂、植物生长刺激素(赤霉素) 、杀虫农药(白僵菌剂)等。 引起人和动物疾病;另有少部分霉菌可产生毒性很强的真菌毒素, Eg.黄曲霉毒素(aflatoxin)等。 霉菌易引起动物和人体传染病, Eg. 皮肤癣症等; 3. 基础理论研究中良好的试验材料 Eg. 粗糙脉孢菌(Neurospora crassa) 构巢曲霉(Aspergillus nidulans) 在微生物遗传学研究中的应用等。 二、霉菌的形态结构 1. 霉菌菌丝细胞结构 霉菌菌丝细胞和酵母一样是真核细胞,都由细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、线粒体、核糖体及内含 物、液泡组成。 大多数霉菌细胞壁成分是多糖(多为几丁质,少数低等的水生性较强的真菌则以纤维素为主) ,可被蜗 牛消化酶水解。 2. 菌丝体(mycelium)

由许多菌丝相互交织而成的一个菌丝集团称菌丝体(mycelium,复数 mycelia) 。 3. 菌丝的特化 营养菌丝和气生菌丝对于不同的真菌来说,在它们的长期进化过程中,对于相应的环境条件已有了高度 的适应性,并明显地表现在产生各种形态和功能不同的特化结构上。也称菌丝的变态。 1)营养菌丝体的特化形态 菌环 菌网 附枝(匍匐菌丝、假根) 附着枝 附着胞 吸器 菌核 菌索 (1)菌环:菌丝交织成套状 (2)菌网:菌丝交织成网状 (3)匍匐菌丝、假根:功能是固着和吸收营养。 (4)附着枝:若干寄生真菌由菌丝细胞生出 1-2 个细胞的短枝,以将菌丝附着于宿主上,这种特殊的 结构即附着枝。 (5)附着胞:许多植物寄生真菌在其芽管或老菌丝顶端发生膨大,并分泌粘性物,借以牢固地粘附在 宿主的表面,这一结构就是附着胞,附着胞上再形成纤细的针状感染菌丝,以侵入宿主的角质层而吸取营养。 (6)吸器:吸收细胞内的营养。 (7)菌核:是一种休眠的菌丝组织。茯苓 (8)菌索:一般由伞菌等产生,为白色根状菌丝组织,功能为促进菌体蔓延和抵御不良环境。 2)气生菌丝体的特化形态 气生菌丝体主要特化成各种形态的子实体,即在其里面或上面可产无性或有性孢子,有一定形状和构造 的任何菌丝体组织。 B. 产生有性孢子的、结构复杂的子实体,称为子囊果(ascocarp) 。 在子囊和子囊孢子发育过程中,从原来的雌器和雄器下面的细胞上生出许多菌丝,它们有规律地将产囊 菌丝包围,形成了由一定结构的子囊果。 3)菌丝体在液体培养时的特化形态 真菌在液体培养基中进行通气搅拌或振荡培养时,易产生菌丝球(mycelial bead)的特殊构造。 菌丝体互相紧密纠缠形成颗粒, 均匀的悬浮于培养液中, 有利于氧的传递以及营养物和代谢产物的输送, 对菌丝的生长和代谢产物形成有利。

三、霉菌的菌落 四、霉菌的繁殖方式 (1)节孢子 菌丝生长到一定阶段时出现横隔膜,然后从隔膜处断裂而形成的细胞称为~。 Eg. 白地霉产生的节孢子 (2)厚垣孢子 某些霉菌种类在菌丝中间或顶端发生局部的细胞质浓缩和细胞壁加厚,最后形成一些厚壁的休眠孢子, 称为~。Eg. 毛霉属中的总状毛霉 (3)孢囊孢子 (4)分生孢子 是在生殖菌丝顶端或已分化的分生孢子梗上形成的孢子,分生孢子有单生、成链或成簇等排列方式,是 子囊菌和半知菌亚门的霉菌产生的一类无性孢子。 2. 有性孢子 经过两性细胞结合而形成的孢子称为有性孢子。经过两性细胞结合产生新个体的过程称为有性繁殖。 有性繁殖一般不普遍,特别在人工培养基上不出现。 霉菌的有性繁殖过程十分复杂,一般分为三个阶段,即质配、核配和减数分裂。 a)质配:两个性细胞结合,细胞质融合,成为双核 细胞,每个核均含单倍染色体(n+n) 。 b)核配:两个核融合,成为二倍体接合子核,此时核 的染色体数是二倍(2n) 。 c)减数分裂:具有双倍体的细胞核经过减数分裂,核中的染色体数目又恢复到单倍体状态。 (1)卵孢子:菌丝分化成形状不同的配子囊,小的叫雄器和大的叫藏卵器,雄器与藏卵器结合后所形 成的有性孢子叫卵孢子。 (2)接合孢子:由菌丝分化成两个形状相同、但性别不同的配子囊结合而形成的有性孢子叫接合孢子。 (3)子囊孢子:菌丝分化成产囊器和雄器,两者结合形成子囊,在子囊内形成的有性孢子即为子囊孢 子。 子囊孢子的形成过程: 雄器的细胞质、细胞核经受精管进入产囊器,质配后产囊器生出许多短短的菌丝称产囊丝,+、-成对的 核进入产囊丝多次分裂,产囊丝生出许多隔膜成多细胞菌丝,产囊丝顶端细胞有 1 个“+”核、1 个“-”核, 该细胞称子囊母细胞,子囊母细胞中两核结合形成 2n 核、一次减数分裂一次有丝分裂,产生 8 个 n 核, 8 个 n 核发育成子囊孢子,此时子囊母细胞即子囊。子囊孢子是在子囊内形成的有性孢子。 (4)担孢子:菌丝经过特殊的分化和有性结合形成担子,在担子上形成的有性孢子即为担孢子。 霉菌有性孢子繁殖的特点:

a)霉菌的有性繁殖不常见。 b)有性繁殖方式因菌种不同而异,有的两条营养菌丝就可以直接结合,有的则由特殊的性细胞(性器 官)--------配子囊或由配子囊产生的配子来相互交配,形成有性孢子。 c)核配后一般立即进行减数分裂,因此菌体染色体数目为单倍,双倍体只限于接合子。 d)霉菌的有性繁殖存在同宗配合和异宗配合两种情况。 3. 生活史 无性繁殖阶段;菌丝体(营养体)在适宜的条件下产生无性孢子,无性孢子萌发形成新的菌丝体,多次 重复。 有性繁殖阶段;在发育后期,在一定条件下,在菌丝体上分化出特殊性器官(细胞) ,质配、核配、减 数分裂后形成单倍体孢子,再萌发形成新的菌丝体。 有一些霉菌,至尽尚未发现其生活史中有有性繁殖阶段,这类真菌称为半知菌 4. 霉菌孢子与细菌芽孢的比较

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五、发酵工业上常见常用的霉菌 (一)毛霉属(mucor Micheli ex Fries) 毛霉是较为低等的真菌,生长迅速,菌丝发达,在基质上或基质内能广泛蔓延,菌丝不分隔,不产生假 根和匍匐枝,是单细胞真菌,在分类上属于接合菌亚门或亚纲。 毛霉以孢囊孢子的形式进行无性繁殖,孢子梗直接由菌丝体生出,顶端有一个球形的孢子囊,囊内有囊 轴,囊轴与孢子囊梗直接相连,孢子囊成熟后,囊壁易消失或破裂。 毛霉中有的菌 eg. 总状毛霉能产生厚垣孢子,有性繁殖是异宗配合,产生接合孢子。 毛霉中的许多种分解蛋白质能力很强,豆腐乳、豆豉的制作均用毛霉。 (二)根霉属(Rhizopus Ehrenberg) 根霉和毛霉很相似,不同的是根霉有假根和匍匐菌丝。匍匐菌丝呈弧形,在培养基表面水平生长。分枝 状的假根伸入培养基内,与假根相对处向上生出孢子梗,顶端形成孢子囊,内生孢囊孢子。孢子囊内具囊轴, 囊轴茎部与孢子囊梗相连处有囊托。以孢囊孢子的形式进行无性繁殖,有性繁殖形成接合孢子,根霉对酿酒 业具有特殊作用,我国用淀粉发酵生产酒、酒精,由于酵母不能直接利用淀粉,所以淀粉的糖化用的就是根 霉,根霉具有活力很强的淀粉酶。根霉也是导致瓜果蔬菜腐烂的主要菌。 (三)红曲霉 红曲霉在麦芽+琼脂上生长良好,菌落为膜状的蔓延生长物,表面有皱纹。菌落开始为白色,成熟后变 为红紫色等,能向培养基中分泌红色色素。

菌丝分隔、多核、多分枝,分生孢子在菌丝及其分枝的顶端,2~6 个成串,分生孢子大多为梨形,多核。 红曲霉有性繁殖是形成子囊孢子,其子囊果是闭囊壳,闭囊壳是球形的,有柄,闭囊壳内散生十多个子 囊,子囊也是球形的,有 8 个子囊孢子。 红曲霉能产生淀粉酶、麦芽糖酶、蛋白酶、柠檬酸、琥珀酸、乙醇,能提取天然食用色素,用于制作黄 酒、醋、红腐乳等。 (四)曲霉 曲霉菌丝体发达,菌丝分隔,菌丝体产生大量的分生孢子梗,分生孢子梗顶端膨大成为顶囊,顶囊一般 是球形的,顶囊表面长满一至二层辐射状的小梗称分生孢子小梗,小梗顶端着生成串的球形分生孢子,分生 孢子梗生在足细胞上,并通过足细胞与营养菌丝相连,足细胞是一个特化了的细胞,壁很厚。 曲霉属中大多数种只进行无性繁殖,也有极少数中能产生子囊孢子。 黑曲霉 淀粉酶用于淀粉的糖化、液化; 酸性蛋白酶用于食品制作、消化剂; 果胶酶用于果汁澄清、植物纤维精制; 柚苷酶和橙皮苷酶,用于桔子汁或桔果酱脱苦;产生多种有机酸 eg. 柠檬酸、葡萄糖酸等。 能引起食品等霉变。 黄曲霉,在食品上能产生大量的黄曲霉毒素。黄曲霉毒素具有很强的致癌性,所以食品中只要测出就不 能食用, 黄曲霉产生蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、有机酸等。 黄曲霉的菌落是黄绿色,菌落平坦或有放射性状皱纹,顶囊呈烧瓶形或近似球形。 (五)青霉 青霉在自然界中分布很广,是水果腐烂、粮食等工农业产品霉变的主要菌。青霉的菌落是绿色的,菌丝 有横隔,气生菌丝发达,分生孢子梗顶端不膨大,有扫帚状的分枝,称帚状枝。帚状枝是由单轮、双轮或多 论分支构成。最后一级称小梗,着生小梗的细胞称梗基,小梗上产生分生孢子。 青霉 青霉素、灰黄霉素、柠檬酸、延胡索酸、草酸等纤维素酶, 青霉菌有的也能产生致癌的霉菌毒素。青霉和曲霉中绝大多数未发现有性过程。所以人们还是喜欢把青 霉属和曲霉属归为半知菌,在 Ainsworth 系统中属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目丛梗孢科。

第三节 一、分布及与人类的关系 1. 在自然界分布极广

蕈菌(Mushroom)

蕈菌又称担子菌,伞菌,是高等真菌,通常是指那些能形成大型肉质子实体的真菌,包括大多数担子菌

类和极少数的子囊菌类。 2. 与人类关系密切 食用菌约有 400 多种,其中约 50 种已能进行人工栽培。 Eg. 双孢蘑菇、木耳、银耳、香菇、平菇、草菇、金针菇和竹荪等。 也有许多可供药用的蕈菌,Eg. 茯苓、灵芝、云芝、马勃和猴头等都是名贵药材,称药用菌。近几年

丛担子菌中找到了抗癌物质, Eg. 香菇多糖等。 蕈菌的其他经济用途 例如裂褶菌等产生促生素吲哚乙酸; 许多伞菌、腹菌及多孔菌可产生抗生素; 多种乳菇含有橡胶物质; 很多种大型真菌,如羊肚苗、鬼伞、马勃、蜜环菌、牛肝菌、紫丁香蘑等,可以用现代发酵技术培养它 们的菌丝体作为调味品。 二、蕈菌的形态结构 蕈菌的最大特征是形成形状、大小、颜色各异的大型肉质子子实体。 1.典型的蕈菌的子实体 2. 菌柄 菌柄多数生在菌盖的中央,有的偏生或侧生在一边。 菌柄的质地,有肉质,蜡质,纤维质或脆骨质等; 有的与菌盖不易分离,有的极易分离; 颜色也有多种多样; 形状也各不相同,如圆柱状、棒状、纺锤状、杵状等。 3. 菌丝体 子实体是担子菌长出地面的地上部分,样子很象插在地里的一把伞。地下还有白色丝状,到处蔓延的菌 丝体,这是担子菌的营养体部分,即非繁殖器官。菌丝体有隔,可伸入培养基中吸收养分。在一定温度与湿 度的坏境下,菌丝体取得足够的养料就开始形成子实体。 三、繁殖方式和子实体的形成 担子菌有无性繁殖和有性繁殖。 (一)无性繁殖 大多数担子菌的无性繁殖不发达,通常通过芽殖、菌丝断裂,以及产生分生孢子、节孢子或粉孢子来进 行的。 担孢子可芽殖产生分生孢子,在由分生孢子萌发产生菌丝。 菌丝时常断裂成单细胞的片段,这些片段就是节孢子。 若节孢子来于次生菌丝的,则是双核的;

若节孢子是初生菌丝产生的,则是单核的。 粉孢子是由特殊的、短的菌丝分枝即粉孢子梗从尖端逐个割裂形成的。粉孢子可以直接萌发产生单核的 初生菌丝,也可起性孢子的作用与体细胞菌丝结合。 (二)有性繁殖 担子菌的有性繁殖是形成担孢子。 担孢子着生于棍棒状的担子上。担子起源于双核菌丝的顶端细胞,经过锁状联合之后,顶端细胞逐渐膨 大,双核进行核配,经减数分裂后产生 4 个单倍体核。 (4)担孢子:菌丝经过特殊的分化和有性结合形成担子,在担子上形成的有性孢子即为担孢子。 在蕈菌的生活史上,菌丝体可分五个阶段: ① 初生菌丝(一级菌丝) 担孢子萌发,形成由许多单核细胞构成的菌丝,称为~。 ②次生菌丝(二级菌丝) 不同性别的一级菌丝发生接合后,通过质配形成了由双核细胞构成的~。 通过“锁状联合”形成喙状突起而连合两个细胞的方式不断使双核细胞分裂,从而使菌丝尖端不断向前 延伸。 ③三生菌丝(三级菌丝) 到条件适合时,大量的二级菌丝分化为多种菌丝束,即为~。 ④子实体 菌丝束在适宜条件下会形成菌蕾,然后再分化、膨大呈大型子实体。 ⑤担孢子 子实体成熟后,双核菌丝的顶端膨大,其中的两个核融合形成一个新核,此过程称核配。新核经两次分 裂 (其中有一次为减数分裂) 产生 4 个单倍体子核, , 最后在担子细胞的顶端形成 4 个独特的有性孢子, 即~。 No.9 2004.3.24 10-11 教 203 第三章 病毒和亚病毒

病毒学(virulogy)研究病毒(virus)的本质及其与宿主的相互作用的科学,是微生物学的重要分支 学科。

第一节 一、病毒的发现和研究历史

病毒

第一个记载的植物病毒病当属郁金香碎色花病,至今荷兰阿姆斯特丹的博物馆还保存着一张 1619 年荷 兰画家的一幅得病的郁金香静物画。 当时人们对郁金香病花的狂热了,一枚得病的郁金香球茎竟能换成吨的谷物或上千磅的奶酪。 1886 年,A. Mayer 发现烟草花叶病具有传染性 1898 年,M W Beijerinck 对烟草花叶病病原体的研究结果:

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能通过细菌滤器; 可被乙醇沉淀而不失去其感染性, 能在琼脂凝胶中扩散; 用培养细菌的方法不能被培养出来,推测只能在植物活细胞中生活; 结论:病原是一种比细菌还小的“有传染性的活的流质”。 真正发现病毒存在的是贝叶林克,给病毒起拉丁名叫“Virus”也是他。

一百多年以来,烟草花叶病毒在病毒学发展史乃至遗传学、生物化学以及当代基因工程中起到了里程碑 的作用。 1917 年迪海莱(F. D'Herelle) ? ? ? ? ? ? 痢疾杆菌培养液(浑浊)+ 污水 培养液变清澈 细菌过滤器 清液+痢疾杆菌培养液(浑浊) 培养液变清澈 引起细胞破裂的因子叫噬菌体

二、病毒的特点和定义 1. 特 点 1)不具有细胞结构,具有化学大分子的特征。 Eg. 一些简单的病毒仅由核酸和蛋白质外壳(coat)构成,故可把它们视为核蛋白分子。朊病毒甚至仅 由蛋白质构成 3)大部分病毒不能进行独立的代谢作用。 4)严格的活细胞内寄生,必须依赖宿主细胞进行自身的核酸复制,形成子代。 5)个体微小,在电子显微镜下才能看见 6)对大多数抗生素不敏感,对干扰素敏感。 7)在离体条件下,能以无生命的生物大分子状态存在,并可长期保持其侵染活力。 8)有些病毒的核酸还能整合到宿主的基因组中,并诱发潜伏性感染。 2. 定 义 ★什么是病毒? 病毒(virus)是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的超显微“非细胞生物”,其本质是一种只含 DNA 或 RNA 的遗传因子。 病毒是一类非细胞生物,故称之为病毒粒或病毒体(virion) 病毒颗粒或病毒粒子(virus particle) :专指成熟的、结构完整的和有感染性的单个病毒。 三、病毒的宿主范围

病毒几乎可以感染所有的细胞生物,并具有宿主特异性 (二) 病毒的形态 (三) 典型病毒粒的构造 1.病毒粒的结构 2. 病毒粒的对称体制 3. 病毒的群体形态 (1)包涵体(inclusion body) 病毒粒大量聚集并使宿主细胞发生病变时,就形成了具有一定形态、构造并能用光学显微镜加以观察和 识别的特殊“群体”,称之为包涵体(inclusion body) 。 有的可用肉眼观察, Eg: 由噬菌体在菌苔上形成的“负菌落”即噬菌斑(plaque) ; 由动物病毒在宿主单层细胞培养物上形成的空斑(plaque) ; 由植物病毒在植物叶片上形成的枯斑(lesion,病斑) 。 4. 噬菌体的形态 从结构上噬菌体可分为六个类群 Ⅰ类:有头有尾,尾部可收缩,双链 DNA Ⅱ类:有头有尾,尾部不可收缩,双链 DNA Ⅲ类:有头有尾,尾短不收缩,双链 DNA Ⅳ类:有头无尾,单链 DNA Ⅴ类:有头无尾,单链 RNA Ⅵ类:丝状,单链 DNA 3. 复合对称的代表——T 偶数噬菌体 E.coli 的 T 偶数(even type)噬菌体共有 3 种,即 T2、T4 和 T6。 四、病毒的核酸 ? ? 核酸是病毒的遗传物质; 一种病毒的毒粒只含有一种核酸:DNA 或是 RNA;

五、4 类病毒及其繁殖方式 病毒感染敏感宿主细胞后,病毒核酸进入细胞,通过其复制与表达产生子代病毒基因组和新的蛋白质, 然后由这些新合成的病毒组分装配(assembly)成子代毒粒,并以一定方式释放到细胞外。病毒的这种特殊 繁殖方式称做复制(replication) 。 (一) 原核生物的病毒——噬菌体 1. 噬菌体的繁殖 噬菌体的繁殖一般分为 5 个阶段,即

①吸附 ②侵入 ③增殖(复制与生物合成) ④成熟(装配) ⑤裂解(释放) 根据噬菌体与宿主的关系,噬菌体可以分为 烈性噬菌体:凡在短时间内能连续完成以上 5 个阶段而实现其繁殖的噬菌体,称为烈性噬菌体~。 温和噬菌体:进入菌体后并不进行增殖或引起溶菌。 烈性噬菌体所经历的繁殖过程,称为裂解性周期(lytic cycle)或增殖性周期(productive cycle) 。 现以 E. coli 的 T 偶数噬菌体为代表加以介绍 ①吸附(adsorption) 吸附作用受许多内外因素的影响 ①噬菌体的数量 由于每一宿主细胞表面的特异受体有限,因此所能吸附噬菌体的数目也有一个限量。 每一敏感细胞所能吸附的相应噬菌体的数量,就称感染复数(m.o.i,multiplicity of infection) 。 ②阳离子 Ca2+、Mg2+和 Ba2+等阳离子对吸附有促进作用; Al3+、Fe3+和 Cr3+等阳离子则可引起失活。 ③辅助因子 生物素可促进产谷氨酸细菌噬菌体的吸附作用。 ④pH 值 在中性时有利于吸附, 在 pH<5 和 pH>10 时不易吸附。 ⑤温度 在生长最适温度范围内最有利于吸附。 利用某些理化因子对吸附的促进作用和抑制作用,在发酵工业中对防止噬菌体的污染有一定的意 义。 ② 侵入 T4 通过尾丝吸附于宿主 E.coli 表面。吸附后,由于基板受到构象上的刺激,中央孔开口,释放溶菌酶 并水解部分细胞壁,接着尾鞘蛋白收缩,把尾管插入宿主细胞中。 有尾噬菌体:注射方式将噬菌体核酸注入细胞 通过尾部刺突固着于细胞; 尾部的酶水解细胞壁的肽聚糖,是细胞壁产生小孔;

尾鞘收缩,核酸通过中空的尾管压入胞内,蛋白质外壳留在胞外; 如果大量噬菌体在短时间内吸附于同一细胞上,使细胞壁产生许多小孔,也可引起细胞立即裂解,但并 未进行噬菌体的增殖,这种现象称为自外裂解(Lysis from without) 。 ③增殖 ④成熟(maturation) 新合成的毒粒结构组分组装成完整的病毒颗粒,称做病毒的装配,亦称成熟(maturation) T4 噬菌体的生命旅程 病毒的生活史: 严格细胞内寄生物,只能在活细胞内繁殖。 2. 噬菌体效价的测定 在菌苔上形成一个具有一定形状、大小、边缘和透明度的负菌落称噬菌斑。可用作噬菌体的鉴定指标, 也可用于纯种分离和计数。 效价(titre titer) :表示每毫升试样中所含有的具侵染性的噬菌体粒子数,又称噬菌斑形成单位数 (plaque-forming unit,pfu)或感染中心数(infective centre) 。 测定效价的方法:双层平板法(two layer plating method) 双层平板法主要有以下几个优点: ①加了底层培养基后,可使原来底面不平的玻璃皿的缺陷得到了弥补; ②所形成全部噬菌体斑都接近处于同一平面上,因此不仅每一噬菌斑的大小接近、边缘清晰,而且不致 发生上下噬菌斑的重叠现象; ③因上层培养基中琼脂较稀,故形成的噬菌斑较大,更有利于计数。 3. 一步生长曲线(one step growth curve) 定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线,称作 一步生长曲线或一级生长曲线(one-stepgrowthcurve) 。 反映每种噬菌体的三个最重要的特性参数 潜伏期(latentphase) 裂解期(risephase) 裂解量(burstsize) (1)潜伏期(latentphase) 指噬菌体的核酸侵入宿主细胞后至第一个噬菌体粒子装配前的一段时间,故整段潜伏期中没有一个成熟 的噬菌体粒子从细胞中释放出来。 潜伏期又可分两段: ①隐晦期(eclipsephase) 指在潜伏期前期人为地(用氯仿)裂解细胞,裂解液仍无侵染性的一段时间。

②胞内累积期(intracellularaccumulationphase) 又称潜伏后期,在隐晦期后,如人为地裂解细胞,其裂解液出现侵染性的一段时间。这是噬菌体开 始装配的时期,在电镜下可观察到已初步装配好的噬菌体粒子。 (2)裂解期(risephase) 紧接在潜伏期后的一段宿主细胞迅速裂解、溶液中噬菌体粒子急剧增多的一段时间。 (3)平稳期(plateau) 指感染后的宿主已全部裂解,溶液中噬菌体效价达到最高点后的时期。 一步生长曲线的实验步骤 1、用噬菌体的稀释液感染高浓度的宿主细胞; 2、数分钟后,加入抗噬菌体的抗血清(中和未吸附的噬菌体) ; 3、将上述混合物大量稀释,终止抗血清的作用和防止新释放的噬菌体感染其它细胞; 4、保温培养并定期检测培养物中的噬菌体效价(对噬菌体含量进行计数) ; 5、以感染时间为横坐标,病毒的感染效价为纵坐标,绘制出病毒特征性的繁殖曲线; 潜伏期:不同病毒的潜伏期长短不同,噬菌体以分钟计,动物病毒和植物病毒以小时或天计。 裂解量:噬菌体的裂解量一般为几十到上百个,植物病毒和动物病毒可达数百乃至上万个。 4. 溶源性(lysogeny) 温和噬菌体侵入相应宿主细胞后, 噬菌体 DNA 整合到宿主的基因组上, 并随宿主的复制而进行同步复制, 温和噬菌体侵入并不引起宿主细胞裂解的现象溶源性或溶源现象。 (1)溶源噬菌体(lysogenicphage) 侵入细胞后, 噬菌体的 DNA 只整合在宿主的核染色体组上, 并可长期随宿主 DNA 的复制而进行同步复制, 一般情况下不进行增殖、不引起宿主细胞裂解的噬菌体,称温和噬菌体(temperatephage)或溶源噬菌体 (lysogenicphage) 。 (2)前噬菌体(prophage) 当温和噬菌体侵入其宿主的细胞后,前者的核酸可整合到后者的核基因组(genome,即核染色体)上, 这种处于整合态的噬菌体核酸,称作前噬菌体(prophage) 。 (3)温和噬菌体的三种存在形式 ①游离态 指成熟后被释放并有侵染性的游离噬菌体粒子; ②整合态 指已整合在宿主基因组上的前噬菌体(prophage)状态; ③营养态 指前噬菌体经外界理化因子诱导后,脱离宿主核基因组而处于积极复制、合成和装配的状态。 温和噬菌体的种类很多,常见的有 E.coli 的λ 、Mu-1、P1 和 P2 噬菌体等。

(4)溶源菌(lysogen 或 lysogenic bacteria) 凡能引起溶源性的噬菌体即称温和噬菌体,温和噬菌体的宿主就称溶源菌(lysogen 或 lysogenic bacteria) 。溶源菌是一类能与温和噬菌体长期共存的宿主细胞。 (5)溶源菌的显著特性 ① 溶原性是溶源菌的一个极稳定的遗传特性 ② 自发裂解(spontaneous lysis) 10 -10 ③ 诱导(induction)UV 温和噬菌体的溶源性反应: 烈性噬菌体(virulent phage) : 感染宿主细胞后能在细胞内正常复制并最终杀死细胞,形成裂解循环(lytic cycle) 。 温和噬菌体或称溶源性噬菌体(lysogenic phage) :感染宿主细胞后不能完成复制循环,噬菌体基因组 长期存在于宿主细胞内,没有成熟噬菌体产生。 这一现象称做溶源性(lysogeny)现象,在大多数情况下,温和噬菌体的基因组都整合于宿主染色体中 (如λ 噬菌体) ,亦有少数是以质粒形成存在(如 P1 噬菌体) 。 溶源菌的识别 检验某菌株是否为溶源菌的方法,是将少量溶源菌与大量的敏感性指示菌相混合,然后与上层琼脂培养 基混匀后倒平板,经培养后溶源菌就一一长成菌落。由于溶源菌在细胞分裂过程中有极少数个体会引起自发 裂解,其释放的噬菌体可不断侵染溶源菌菌落周围的指示菌菌苔,于是就形成了一个个中央有溶源菌的小菌 落,四周有透明圈围着的这种独特噬菌斑。
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(二) 植物病毒 植物病毒大多为 ssRNA 病毒,基本形态为杆状、丝状和球状(二十面体) ,一般无包膜。 植物病毒对宿主的专一性通常较差。 Eg.TMV 可侵染十余科、百余种草本和木本植物。 植物患病毒病后,主要出现三类症状: ①因叶绿体被破坏或不能合成新的叶绿素,而引起花叶、黄化或红化等症状; ②植株发生矮化、丛枝或畸形等; ③形成枯斑或坏死等症状。 (三) 人类和脊椎动物病毒 在人类、哺乳动物、禽类、两栖类、爬行类和鱼类等各种脊椎动物中,广泛存在着相应的病毒。 与人类健康有关的病毒超过 300 种,与其他脊椎动物有关的病毒超过 900 种 1.常见的病毒病

Eg.流行性感冒 肝炎 麻疹 腮腺炎 脊髓灰质炎 疱疹 流行性乙型脑炎 狂犬病 艾滋病等 2.肿瘤 在人类的恶性肿瘤中,约有 15%~20%是由于病毒的感染而诱发的。 1933 年理查德·毕肖普(Richard Bishope)发现了第一个 DNA 肿瘤病毒即兔乳头瘤病毒。 1960 年又从猴肾细胞中找到一种猴空泡病毒 40(SV40) 。 SV40 是实验室常用作研究分子病毒学的重要工具,它是在用猴肾细胞培养制备脊髓灰质炎疫苗时发现 的。 研究表明,至少有 3 种病毒与人类肿瘤的密切关系。 肝炎病毒(HBV、HCV)与肝细胞癌; 爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)与伯基特(Burkitt)淋巴瘤、鼻咽癌; 人乳头瘤病毒(HPV)与宫颈癌。 1980 年曾发现人类嗜 T 细胞病毒(HTLV)与人类某些淋巴细胞性白血病的关系,使人类肿瘤病毒病因学 获得巨大突破。 禽、畜等动物的病毒病普遍且危害严重。 Eg.猪瘟、牛瘟、口蹄疫、马传染性病毒病、 兔的乳头状瘤、鸡瘟、鸡新城疫和劳氏肉瘤等。 人畜共患病(zoonosis) :人类和脊椎动物之间自然传播的疾病和感染。 世界上已证实的人畜共患病约有 200 种,其中较重要的有 89 种,病毒病 27 种。 Eg.流行性乙型脑炎、口蹄疫、西部马脑炎、 委内瑞拉马脑炎、狂犬病、禽流感等。 禽流感: (Avian influenza)是由 A 型流感病毒引起的一种禽类感染或疾病综合症,极易在禽鸟间散播, 可引致家禽大量死亡,对家禽业带来不可估量的破坏。 1997 年,香港发生全世界第一宗人类受 H5 型禽流感感染病例,原本只影响鸡的病毒亦令人类患病。受 影响的人数为 18 人,其中 6 人死亡。 口蹄疫:由口蹄疫病毒感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性、接触性传染病,最易感染的动物是黄牛、

水牛、猪、羊、鹿等。 患口蹄疫的动物会出现发热、跛行和在皮肤与皮肤黏膜上出现泡状斑疹等症状。人一旦受到口蹄疫病毒 传染,经过 2-18 天的潜伏期后突然发病,表现为发烧,口腔干热,唇、齿龈、舌边、颊部、咽部潮红,出 现水疱(手指尖、手掌、脚趾) ,同时伴有头痛、恶心、呕吐或腹泻。 (四) 昆虫病毒 已知的昆虫病毒有 1671 种,其中 80%以上都是农、林业中常见的鳞翅目害虫的病原体,因此是害虫生 物防治中的的巨大资源库。 多数昆虫病毒可在宿主细胞内形成光镜下呈多角形的包涵体,称为多角体(polyhedron) 。 多角体在细胞核或细胞质内形成,成分为碱溶性结晶蛋白,其内包裹着数目不等的病毒粒。功能是保护 病毒粒免受外界不良环境的破环。 此外,在人类的恶性肿瘤中,约有 15%是由于病毒的感染而诱发的。 1933 年理查德·毕肖普(Richard Bishope)发现了第一个 DNA 肿瘤病毒即兔乳头瘤病毒。 1953 年路德维克·格罗斯(Ludwik Gross)等分离到一种能引起多类组织(腮腺、肾、骨、乳腺)发生 肿瘤的病毒,称之为多瘤病毒。

第二节

亚病毒(subvirus)

凡在核酸和蛋白质两种成分中,只含其中一种的分子病原体,称为亚病毒(subvirus) ,包括类病毒、 拟病毒和朊病毒 3 类。 一、类病毒(Viroid) 类病毒(viroid)是一类只含 RNA 一种成分、专性寄生在活细胞内的分子病原体。 目前只在植物体中发现,所含核酸为裸露的环状 ssRNA,其二级结构象一段末端封闭的短 dsRNA 分子。 1971 年在美国工作的瑞士学者 T. O. Diener 在马铃薯纺锤形块茎病 (potatospindletuberdisease, PSTD) 中 发 现 一 条 比 一 般 病 毒 分 子 更 小 的 10S 的 区 带 , 他 称 它 为 马 铃 薯 纺 锤 形 块 茎 病 类 病 毒 (potatospindletuberviroid,PSTV) ,它可使马铃薯减产 20~70%。 二、拟病毒(Virusoid) 拟病毒(virusoids)又称类类病毒(viroid-like) 、壳内类病毒或病毒卫星(satellite) ,是指一类 包裹在真病毒粒中的有缺陷的类病毒。 拟病毒极其微小,一般仅由裸露的 RNA(300~400 个核苷酸)或 DNA 所组成。 被拟病毒“寄生”的真病毒又称辅助病毒(helper virus) ,拟病毒则成了它的“卫星”。 拟病毒的复制必须依赖辅助病毒的协助, 同时, 拟病毒也可干扰辅助病毒的复制和减轻其对宿主的病害, 这可用于生物防治中。 三、朊病毒(Prion) 朊病毒(prion,virino)又称“普列昂”或蛋白质侵染因子(prion,是 protein infection 的缩写) ,

是一类不含核酸的传染性蛋白质分子,因能引起宿主体内现成同类蛋白质分子发生与其相似构象变化,从而 可使宿主致病。 朊病毒由美国学者 S. B. Prusiner 于 1982 年研究羊骚痒病时发现的。由于其意义重大,故他于 1997 年获得了诺贝尔奖。 至今已发现与哺乳动物脑部相关的 10 余种疾病都是由朊病毒所引起的。这类疾病的共同特征是潜伏期 长,对中枢神经的功能有严重影响。 朊病毒是一类小型蛋白质颗粒,约由 250 个氨基酸组成,大小仅为最小病毒的 1%,而且毒性很强。 朊病毒与真病毒的主要区别 ①呈淀粉样颗粒状 ②无免疫原性 ③无核酸成分 ④由宿主细胞内的基因编码 ⑤抗逆性强,能耐杀菌剂(甲醛)和高温(经 120~130℃处理 4h 后仍具感染性)

第三节 一、噬菌体与发酵工业 1.噬菌体对发酵工业的危害 当发酵液受噬菌体严重污染时,会出现: ①发酵周期明显延长 ②碳源消耗缓慢; ③发酵液变清,镜检时,有大量异常菌体出现;

病毒与实践

④发酵液泡沫增加,发酵产物的形成缓慢或根本不形成; ⑤用敏感菌作平板检查时,出现大量噬菌斑; ⑥用电子显微镜观察时,可见到有无数噬菌体粒子存在。 轻则延长发酵周期、影响产品的产量和质量, 重则引起倒罐甚至使工厂被迫停产 要防治噬菌体的危害,必须确立“防重于治”的观念。 预防噬菌体污染的措施主要有: (1)决不使用可疑菌种 (2)严格保持环境卫生 (3)严禁活菌排放(决不丢弃和排放有生产菌种的菌液) (4)注意通气质量,高空采风 (5)加强发酵罐和管道灭菌

(6)不断筛选抗噬菌体菌种,并经常轮换生产菌种 (7)严格执行会客制度 噬菌体的应用 噬菌体由于其独特的生物学特性,在人类的生产实践和理论研究中都很有价值。 1.用于鉴定未知细菌 噬菌体对宿主具有高度专一性,可用于细菌菌种的分类鉴定,可用于临床诊断和流行病学调查。 2.用于临床治疗 噬菌体制剂 3.植物病原菌检验 4.生物防治 噬菌体———植物病原菌 昆虫病毒———害虫 5.测定辐射剂量 某些噬菌体(T2)对辐射反应敏感而精确,可通过测定辐射的生物效应而计算出辐射剂量。 6.理论研究中的理想材料 遗传学研究中很多基本理论问题的研究都是用噬菌体做工具或材料;基因工程中作载体。 发现噬菌体污染时,要及时采取合理措施 ①尽快提取产品 ②使用药物抑制长期来,人类在与有害昆虫作斗争的过程中,曾采用过多种手段,诸如物理治虫、化学 治虫、绝育除虫、性激素引诱治虫和生物治虫(包括动物治虫、以虫治虫、细菌治虫、真菌治虫和病毒治虫) 等, ③及时改用抗噬菌体生产菌株 二、昆虫病毒用于生物防治 病毒治虫 主要优点 (1)致病力强,使用量少 (2)专一性强,安全可靠 (3)抗逆性强,作用久长 (4)生产简便,成本低廉 缺点:杀虫范围窄。

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2004.3.31 第四章

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微生物的营养和培养基食谱广、胃口大——微生物特点之一

营养(nutrition) :指生物体从外部环境中摄取对其生命活动必需的能量和物质,通过吸收利用以满足 正常生长和繁殖需要的一种最基本的生理功能。摄取生物有机体吸收利用营养物质为一切生命活动提供了必 需的物质基础! 营养物(nutrient) :指具有营养功能的物质,那些能够满足微生物机体生长、繁殖和完成各种生理活 动所需的物质。 在微生物学中,它还包括非常规物质形式的光辐射能在内。微生物的营养物可为它们的正常生命活动提 供结构物质、能量、代谢调节物质和必要的生理环境。 本章内容: 第一节 微生物的 6 类营养要素 第二节微生物的营养类型 微生物们需要吃什么? 第三节 营养物质进入细胞 微生物们是怎样吃东西的? 第四节 培养基 如何给微生物们做饭? 第一节 微生物的 6 类营养要素 一、 生物细胞的化学组成 1. 化学元素(chemical element) 构成微生物细胞的物质基础是各种化学元素! 细胞化学元素组成 生命元素 主要元素:碳、氢、氧、氮 90~97%

大量元素:磷、硫、钾、镁、钙、铁等; 微量元素:锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等。组成微生物细胞的各类化学元素的比例 常因微生物种类的不同而不同 Eg. 细菌、酵母菌和真菌的碳、氢、氧、氮、磷、硫六种元素的含量就有差别。 硫细菌(sulfur bacteria)、铁细菌(iron bacteria)和海洋细菌(marine bacteria)相对于其他细菌则 含有较多的硫、铁和钠、氯等元素, 硅藻(Diatom)需要硅酸来构建富含(SiO2)n 的细胞壁。 2. 化学成分及其分析有机物蛋白质、糖、脂、核酸、维生素等及其降解产物干物质的 比例 微生物 球菌 酵母 mold 二、微生物的 6 类营养要素 蛋白质% 40-50 40-60 20-40 碳水化合物 10-25 25 20

在元素水平上都需 20 种左右, 且以碳、氢、氧、氮、硫、磷 6 种元素为主; 在营养要素水平上则都在六大类的范围内, 即碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水。 微生物、动物、植物之间存在“营养上的统一性” (一)碳源(carbon source) 1. 定义 一切能满足微生物生长繁殖所需碳元素的营养物,称为碳源。 微生物细胞含碳量约占干重的 50%,除水分外,碳源是需要量最大的营养物,又称之为大量营养物 (macronutrients) 。 碳源谱(spectrum of carbon sources) :如把微生物作为一个整体来看,其可利用的碳源范围即碳源 谱。 对一切异养微生物来说, 其碳源同时又兼作能源, 这种碳源称为双功能营养物 (difunctional nutrient) 。 2. 种类 微生物的碳源物质很多,有糖类及其衍生物、有机酸类、醇类、脂类、烃类、蛋白质及其降解产物等。 不同种类的微生物对碳源的利用能力也不一样! Eg. 假单胞杆菌属的一些菌能利用 90 多种不同的碳源物质。 甲烷氧化菌只能利用甲烷和甲醇作碳源。 (1)糖 单糖>双糖和多糖 己糖> 戊糖 葡萄糖、果糖> 甘露糖、半乳糖 淀粉> 纤维素或几丁质等纯多糖 纯多糖> 琼脂等杂多糖 葡萄糖可作为大多数微生物的碳源! (2)酚、氰化物等有毒物质 (3)CO2 最廉价的、用之不尽的碳源 是自养微生物唯一或主要的碳源 (4)纤维素 纤维素是由葡萄糖以β -1,4 糖苷链组成的,在自然界中资源丰富,但大多数动物和人不能直接利用, 而某些微生物可用其作为碳源来生产发酵产品。 (5)烃类烃类化合物也能被微生物用作碳源,且微生物氧化烃类的许多中间产物和最终产物均是重要

的工业原料。 在发酵工业中最常用的碳源是 葡萄糖、淀粉、废糖蜜、 麸皮和米糠等。 3. 功能 (1)构成细胞物质 (2)构成各种代谢产物和细胞贮藏物质 (3)为微生物进行生命活动提供能量 (二)氮源(nitrogen source) 1. 定义 凡能提供微生物生长繁殖所需氮元素的营养源,称为氮源。 氮是构成重要生命物质蛋白质和核酸等的主要元素,氮占细菌干重的 12%~15%,也是微生物的主要营 养物。 氮源谱( nitrogen of nitrogen sources) : 如把微生物作为一个整体来看,其可利用的氮源范围即氮源谱。 2. 种类 (三)能源(energy source) 1. 定义 能为微生物生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能,称为能源。 化能自养微生物的能源为一些还原态的无机物质, Eg. NH4+、NO2-、S、H2S、H2 和 Fe2+等。 能氧化利用这些物质的微生物都是细菌, Eg.硝酸细菌、亚硝酸细菌、硫化细菌、硫细菌、氢细菌和铁细菌等。 单功能营养物 Eg.光辐射能(能源) 双功能营养物 Eg.还原态的无机物 NH4+ (氮源、能源) 三功能营养物 Eg.氨基酸类(碳源、氮源、能源) (四)生长因子(growth factor) 1. 定义 是一类调节微生物正常代谢所必需,但不能用简单的碳、氮源自行合成的需要量很小的一类有机物。 各种微生物与生长因子的关系可分以下几类:

1)生长因子自养型微生物(auxoautotrophs) 它们不需要从外界吸收任何生长因子,多数真菌、放线菌和不少细菌,如 E.coli(大肠杆菌)等都属 这类。 (2)生长因子异养型微生物(auxoheterotrophs) 它们需要从外界吸收多种生长因子才能维持正常生长,如各种乳酸菌、动物致病菌、支原体和原生动物 等。 (3)生长因子过量合成微生物 少数微生物在其代谢活动中, 能合成并分泌出大量的维生素等生长因子, 可作为有关维生素的生产菌种。 2. 种类 广义的生长因子: 维生素、碱基、卟啉及其衍生物、甾醇、胺类、 C4~C6 的分枝或直链脂肪酸, 以及需要量较大的氨基酸; 狭义的生长因子: 一般仅指维生素。 a.维生素 维生素作为一些酶的辅酶, Eg. 维生素 B6(吡哆醛) , 磷酸吡哆醛是一些转氨酶和氨基酸脱羧酶的辅酶。 微生物对维生素的需要量一般是 1~5mg/ml b.氨基酸 氨基酸是蛋白质合成的基本单位,在大多数情况下可被微生物吸收利用;少数情况下微生物虽需要氨基 酸作为生长因子,但氨基酸不能透过细胞膜,而能够吸收利用小肽。 在培养基中一种氨基酸的含量过高,会抑制细胞对其他氨基酸的摄取,此现象称氨基酸不平衡。 微生物对氨基酸的需要量一般是 20mg/ml c.碱基 碱基是核酸、核苷酸及一些辅酶的组分; 一般情况下,核苷酸不能用作生长因子,因为它不能透过

细胞膜。微生物对碱基的需要量一般是 10~20mg/ml d.其他生长因子 有些微生物的生长需要一些很特殊的物质,也称生长因子。 Eg.流感嗜血杆菌一定要在含红细胞的培养基上生长,因为它需要卟啉环作生长因子。 厌氧条件下生长的啤酒酵母需要甾醇作为生长因子。 在配制微生物培养基时,一般可用生长因子含量丰富的天然物质作原料以保证微生物对它们的需要。

Eg.如果配制的是天然培养基,则可加入 酵母膏(yeast extract) 、 玉米浆(cornsteep liquor,一种浸制玉米以制取淀粉后产生的副产品) 、 肝浸液(liver infusion) 、 麦芽汁(malt extract) 、 其他新鲜的动、植物的汁液; 如果配制的是组合培养基,则可加入复合维生素溶液。 3. 生长因子的微生物分析法 (五)无机盐(mineral salts) 1. 定义 无机盐(mineral salts)或矿质元素主要可为微生物提供除碳、氮源以外的各种重要元素。 (六)水在生物体内的作用 (1)水是细胞的重要组成成分。 (2)水直接参与代谢反应,许多反应都涉及脱水和水合。 (3)水是活细胞中各种生化反应的介质。 (4)营养物质、代谢产物都必须溶于水中才能被运输。 (5)水比热高、气化热高、沸点高,又是热的良导体,可调节细胞的温度。 (6)水是维持细胞膨压的必要条件。 (七)气体 1. 氧气 需氧微生物的能量代谢需要氧气的存在 微生物发酵中给氧的方法有搅拌、振荡,通气等 CO2 是自养微生物的碳源,也常被异养微生物用于固定延长碳链。 Eg. 丙酮酸羧化为草酰乙酸 有些生长在动物体内的致病菌生长需要少量的 CO2,在培养时要提供 10%的 CO2 (V/V) ,可用 CO2 培养 箱。 水是细胞维持正常生命活动所必不可少的,一般可占细胞重量的 70~90%。细胞湿重(wet weight)与干重 (dry weight)之差为细胞含水量,常以百分率表示:湿重-干重/湿重×100% 。 湿重:将细胞外表面所吸附的水份除去后称量所得重量,一般以单位培养液中所含细胞重量表示(克/ 升或毫克/毫升) 。 干重:采用高温(105℃)烘干、低温真空干燥和红外线快速烘干等方法将细胞干燥至恒重即为~。 a.有机氮 主要由蛋白质及蛋白质的各种降解产物———蛋白胨、氨基酸、小肽和尿素等。

实验室常用的有机氮源有:牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、蚕蛹粉、黄豆粉和花生粉等。 b.无机氮 主要包括硝酸盐、铵盐、铵等。 铵盐是绝大部分微生物的有效氮源,吸收后能被直接被利用; 硝酸盐也能被大部分微生物利用,但吸收后需被还原成 NH3 才能进入合成代谢。 铵盐 Eg.(NH4)2SO4 作氮源,随着 NH4+的消耗培养基的 pH 值下降。 铵盐被称作生理酸性盐 硝酸盐 Eg.KNO3 作氮源,随着 NO3-的消耗培养基的 pH 会上升。 硝酸盐被称作生理碱性盐 c.分子氮 分子氮即为大气中的 N2。 能利用 N2 作氮源来合成细胞结构的微生物我们称固氮微生物。 (1)研究微生物的固氮作用是生物领域中的一个重大课题。通过基因工程把微生物的固氮基因转移到 高等植物的基因组中,使之可利用 N2。 (2)固氮微生物具有固氮酶,可在常温常压下把 N2 + H2 NH3

研究固氮酶作为一种酶制剂生产出来,在进一步在生产 NH3。 (1)大量元素(macroelements) 凡是生长所需浓度在 10-3~10-4mol/L 范围内的元素,可称为大量元素(macroelements) , 例如 P、S、K、Mg、Ca、Na 和 Fe 等。 (2)微量元素( microelements ) 凡所需浓度在 10-6~10-8mol/L 范围内的元素,则称为微量元素(microelements) , 如 Cu、Zn、Mn、Mo、Co 和 Ni、Sn、Se 等。

第二节

微生物的营养类型

营养类型是指根据微生物生长所需要的主要营养要素即能源和碳源的不同,而划分的微生物类型。 二、微生物营养类型(Ⅱ) 1.光能无机营养型 (光能自养型,photoautotroph) 能以 CO2 为主要唯一或主要碳源; 进行光合作用获取生长所需要的能量; 以无机物如 H2、H2S、S 等作为供氢体或电子供体,使 CO2 还原为细胞物质; 例如,藻类及蓝细菌等和植物一样,以水为电子供体(供氢体) ,进行产氧型的光合作用,合成细胞物

质。而红硫细菌,以 H2S 为电子供体,产生细胞物质,并伴随硫元素的产生。 2.光能有机营养型 (光能异养型,photoheterotroph) 不能以 CO2 为主要或唯一的碳源; 以有机物作为供氢体,利用光能将 CO2 还原为细胞物质; 在生长时大多数需要外源的生长因子; 这类微生物能利用有机物迅速繁殖,常用于污水处理。 例如,红螺菌属中的一些细菌能利用异丙醇作为供氢体,将 CO2 还原成细胞物质,同时积累丙酮。 光能无机自养型和光能有机异养型微生物可利用光能生长,在地球早期生态环境的演化过程中起重要作 用。 3.化能无机营养型 (化能自养型,chemoautotroph) 生长所需要的能量来自无机物氧化过程中放出的化学能; 以 CO2 或碳酸盐作为唯一或主要碳源进行生长时,利用 H2、H2S、Fe2+、NH3 或 NO2-等作为电子供体使 CO2 还原成细胞物质。 可在完全无机及无光的环境中生长。 它们广泛分布于土壤及水环境中,参与地球物质循环。 4.化能有机营养型 (化能异养型,chemoheterotroph) 生长所需要的能量均来自有机物氧化过程中放出的化学能; 生长所需要的碳源主要是一些有机化合物,如淀粉、糖类、纤维素、有机酸等。 有机物通常既是碳源也是能源! 大多数细菌、放线菌、原生动物、几乎全部的真菌都是化能有机异养型微生物; 所有致病微生物均为化能有机异养型微生物; 不同营养类型之间的界限并非绝对: 异养型微生物并非绝对不能利用 CO2; 自养型微生物也并非不能利用有机物进行生长; 有些微生物在不同生长条件下生长时,其营养类型也会发生改变; 例如紫色非硫细菌(purple nonsulphur bacteria) : 没有有机物时,同化 CO2, 为自养型微生物; 有机物存在时,利用有机物进行生长,为异养型微生物; 光照和厌氧条件下,利用光能生长,为光能营养型微生物; 黑暗与好氧条件下,依靠有机物氧化产生的化学能生长,为化能营养型微生物;

微生物营养类型的可变性无疑有利于提高其对环境条件变化的适应能力 5.营养缺陷型(auxotroph)和原养型(prototroph) 某些菌株发生突变(自然突变或人工诱变)后,失去合成某种(或某些)对该菌株生长必不可少的物质(通 常是生长因子如氨基酸、维生素)的能力,必须从外界环境获得该物质才能生长繁殖,这种突变型菌株称为 营养缺陷型(auxotroph) ; 相应的野生型菌株称为原养型(prototroph) 。 营养缺陷型菌株经常用来进行微生物遗传学方面的研究。 腐生型(metatrophy):可利用无生命的有机物(如动植物尸体和残体)作为碳源; 寄生型(paratrophy):寄生在活的寄主机体内吸取营养物质,离开寄主就不能生存; 在腐生型和寄生型之间还存在中间类型: 兼性腐生型(facultive metatrophy); 兼性寄生型(facultive paratrophy);

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教 307 第三节 营养物质进入细胞的方式

微生物们是怎样吃东西的? 一、物质运输的障碍 微生物在生长过程中,需营养物质不断的进入细胞,代谢产物及时的分泌到胞外,这两个过程就是物质 的运输。 1.荚膜与粘液层 荚膜和粘液层是由一层结构疏松的多糖物质组成,所以对大多数物质进入细胞影响不大。 2.细胞壁 肽聚糖组成的网状结构,只允许一定分子量以下的小分子物质进入,大分子物质就不能通过肽聚糖的网 眼孔。 微生物细胞壁允许进入的分子大小 ? ? ? ? 3.细胞膜 巨大芽孢杆菌 G+菌 霉菌 酵母 小于 5 万 小于 1 万 小于 4.5 万 小于 0.45 万

细胞膜具有选择性渗透作用,即细胞膜允许一种物质比另一种物质更容易通过的特性。这是对物质运输 影响最大的,它能保证对细胞有用的营养物质进入,无用的代谢产物排出,并防止无用物质的进入和有用物 质的漏出,使细胞与外界合理的进行物质交换。 二、物质运输方式 除了原生动物外,其他各大类有细胞的微生物都是通过细胞膜的渗透和选择吸收作用而从外界吸取营养 物的。

1.单纯扩散(简单扩散,simple diffusion) (1)定义 单纯扩散(simple diffusion)又称被动运送(passive transport) ,指疏水性双分子层细胞膜(包括 孔蛋白在内)在无载体蛋白参与下,单纯依靠物理扩散方式让许多小分子、非电离分子尤其是亲水性分子被 动通过的一种物质运送方式。 (2)特点 扩散是非特异性的,不需载体蛋白协助; 扩散过程中,物质不与膜上各类分子发生反应,自身分子结构也不发生变化; 不消耗能量,物质扩散的动力来自参与扩散的物质在膜内外的浓度差; 通过这种方式运送的物质种类不多,主要是一些气体分子(O2、CO2) 、脂肪酸、乙醇、甘油、苯及某些 氨基酸分子。 单纯扩散对营养物的运送 缺乏选择能力和逆浓度梯度的“浓缩”能力, 不是细胞获取营养物质的主要方式。 蔗糖浓度与蔗糖进入细胞的速度 2.促进扩散(facilitated diffusion) (1)定义 促进扩散(facilitated diffusion)指溶质在运送过程中,必须借助存在于细胞膜上的底物特异载体 蛋白(carrier protein)的协助,但不消耗能量的一类扩散性运送方式。 载体蛋白有时称作透性酶(permease) 、移位酶(translocase)或移位蛋白(translocator protein) , 一般通过诱导产生,它借助自身构象的变化,在不耗能的条件下可加速把膜外高浓度的溶质扩散到膜内,直 至膜内外该溶质浓度相等为止。每种载体只运输相应的物质,具有较高的专一性。 载体只影响物质的运输速率, 并不改变该物质在膜内外形成的动态平衡状态 (2)特点 物质运送必须借助存在于细胞膜上的底物特异载体蛋白的协助;

载体蛋白对被运送的物质具有高度专一性; 不消耗能量,物质扩散的动力来自参与扩散的物质在膜内外的浓度差; 例如:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)对各种 糖、氨基酸和维生素的吸收;

E. coli 对甘油的吸收等。
大肠杆菌 ? ? ? ? K+ 碘 主动 逆浓度梯度 胞内高于胞外 3000 倍 胞内高于胞外 106 倍

3.主动运送(active transport) (1)定义 主动运送(active transport)指一类须提供能量(包括 ATP、质子动势或“离子泵”等)并通过细胞 膜上特异性载体蛋白构象的变化,而使膜外环境中低浓度的溶质运入膜内的一种运送方式。属于逆浓度梯度 运送营养物的方式。 4.基团移位(group translocation) (1)定义 基团移位(group translocation)指一类既需特异性载体蛋白的参与,又需耗能的一种物质运送方式, 其特点是溶质在运送前后还会发生分子结构的变化。 (2)特点 物质运送必须借助存在于细胞膜上的底物特异载体蛋白的协助 溶质在运送前后发生分子结构的变化; 需消耗能量; 基团移位主要用于运送各种糖类(葡萄糖、果糖、甘露糖和 N-乙酰葡糖胺等) 、核苷、脂肪酸等物质。 基团移位的运送机制 在 E. coli 中研究得较为清楚, 主要靠磷酸转移酶系统(phosphotrasferase system)即磷酸烯醇式丙酮酸-己糖磷酸转移酶系统进行。 此系统由 24 种蛋白组成,运送某一具体糖至少有 4 种蛋白参与,其特点是每输入一个葡萄糖分子,就 要消耗一个 ATP 的能量。 具体运送分两步进行: (1)热稳载体蛋白(heat-stable carrier protein,HPr)的激活 细胞内高能化合物——磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的磷酸基团通过酶Ⅰ的作用而把 HPr 激活: PEP + HPr Pyr(丙酮酸) + P~HPr

HPr 是一种低分子量的可溶性蛋白,结合在细胞膜上,起着高能磷酸载体的作用。

酶Ⅰ是一种可溶性细胞质蛋白。 HPr 和酶Ⅰ在磷酸转移酶系统中,均无底物特异性。 (2)糖经磷酸化而运入细胞膜内 膜外环境中的糖先与膜外表面上的特异膜蛋白——酶Ⅱc 结合,接着糖分子被由 P~HPr 酶Ⅱa 酶Ⅱb 逐 级传递来的磷酸基团激活,最后通过酶Ⅱc 在把这一磷酸糖释放到细胞质中。 例如: E. coli、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 和巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)中,葡萄糖是通过基团移位方式自外环境运送入细胞内的。

第四节

培养基

培养基(medium,复数 media;或 culture medium)是指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代 谢产物用的混合营养料。 (参见 P91)碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水 任何培养基都应具备微生物所需要的六大营养要素,其间的比例是合适的? 绝大多数微生物都可在人工培养基上生长,只有少数难养菌(fastidious microorganisms)至今无法在人 工培养基上生长。 一、选用和设计培养基的原则和方法 (一)配制培养基的 4 个原则 1.目的明确 培养不同的微生物必须采用不同的培养条件; 培养目的不同,原料的选择和配比不同; 例如枯草芽孢杆菌: 一般培养:肉汤培养基或 LB 培养基; 自然转化:基础培养基; 观察芽孢:生孢子培养基; 产蛋白酶:以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基; 根据不同的工作目的,微生物不同的营养需要,运用自己丰富的生物化学和微生物学知识来配制最佳的 培养基。 2.营养协调 微生物细胞组成元素的调查或分析,是设计培养基时的重要参考依据。 微生物细胞内各种成分间有一较稳定的比例。 在大多数化能异养菌的培养基中,各营养要素间在量上的比例大体符合以下十倍序列的递减规律:

(1)选择适宜的营养物质 实验室的常用培养基:

细菌:

牛肉膏蛋白胨培养基(或简称普通肉汤培养基) ;

放线菌:高氏 1 号合成培养基培养; 酵母菌:麦芽汁培养基; 霉菌: 查氏合成培养基; 实验室一般培养:普通常用培养基; 遗传研究:成分清楚的合成培养基; 生理、代谢研究:选用相应的培养基配方; (2)营养物质浓度及配比合适 营养物质的浓度适宜; 营养物质之间的配比适宜; 高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长,反而起到抑制或杀菌作用。 培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和(或)代谢产物的形成和积累,其 中碳氮比(C/N)的影响较大。 真菌需 C/N 比较高的培养基; (素食) 细菌(动物病原菌)需 C/N 比较低的培养基; (荤食) 发酵生产谷氨酸时: 碳氮比为 4/1 时,菌体大量繁殖,谷氨酸积累少; 碳氮比为 3/1 时,菌体繁殖受到抑制,谷氨酸产量则大量增加。 NH3 > CO(NH2)2 > NH4NO3 > (NH4)2CO3 > (NH4)2SO4 含氮量(82%) (46%) (35%) (29.2%) (21%)

这说明在同样重量时,在以上各氮源中含氮量以氨为最高,尿素次之,硝酸铵和碳酸铵更次之,而硫酸 铵则最低。 3.理化适宜 指培养基的 pH 值、渗透压、水活度和氧化还原电势等物理化学条件较为适宜。 (1) pH 各大类微生物都有其生长适宜的 pH 范围, 培养基的 pH 必须控制在一定的范围内, 以满足不同类型微生 物的生长繁殖或产生代谢产物。 在微生物的生长、代谢过程中会产生引起培养基 pH 改变的代谢产物,为了维持培养基 pH 的相对恒定, 通常要进行 pH 的调节。 (2)渗透压和水活度 渗透压(osmotic pressure)是某水溶液中一个可用压力来量度的一个物化指标。 它表示两种浓度不同的溶液间被一个半透性薄膜隔开时, 稀溶液中的水分子会因水势 (water potentiality) 的推动而透过隔膜流向浓溶液,直到浓溶液产生的机械压力足以使两边水分子的进出达到平衡为止,这时由

浓溶液中的溶质所产生的机械压力,即为它的渗透压值。 与微生物细胞渗透压相等的等渗溶液最适宜微生物的生长; 高渗溶液会使细胞发生质壁分离; 低渗溶液则会使细胞吸水膨胀,形成很高的膨压,这对细胞壁脆弱或丧失的各种缺壁细胞,例如原生质 体、球状体或支原体来说,则是致命的。 水活度即 aw(wateractivity) 是一个比渗透压更有生理意义的一个物化指标。它表示在天然或人为环境中,微生物可实际利用的自由 水或游离水的含量。 (3)氧化还原电势(redox potential) 又称氧化还原电位,是度量某氧化还原系统中还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标。 一般以 Eh 表示, 它是指以氢电极为标准时某氧化还原系统的电极电位值, 单位是 V (伏) mV 或 (毫伏) 。 不同类型微生物生长对氧化还原电位的要求不同 好氧性微生物:+0.1 伏以上时可正常生长,以+0.3~+0.4 伏为宜; 厌氧性微生物:低于+0.1 伏条件下生长; 兼性厌氧微生物:+0.1 伏以上时进行好氧呼吸,+0.1 伏以下时进行发酵。 氧化还原电位与氧分压和 pH 有关,也受某些微生物代谢产物的影响,增加通气量(如振荡培养、搅拌)提 高培养基的氧分压,或加入氧化剂,从而增加 Eh 值; 在培养基中加入巯基乙醇、抗坏血酸(Vc,0.1%) 、硫化氢(0.025%)、半胱氨酸(<0.05%) 、谷胱甘肽、 铁屑、二硫苏糖醇、庖肉(瘦牛肉粒)等还原性物质可降低 Eh 值。 测定氧化还原电势除用电位计外,还可在培养基中加入化学指示剂刃天青(resazurin)进行间接测定。 刃天青在无氧条件下呈无色(Eh=-40 mV) ; 在有氧条件下,其颜色与溶液的 pH 相关; (中性——紫色;碱性——蓝色;酸性——红色) 在微量氧时,它呈粉红色。 以工农业生产中易污染环境的废弃物作为培养微生物的原料。 例如,糖蜜(制糖工业中含有蔗糖的废液)、 乳清(乳制品工业中含有乳糖的废液)、 豆制品工业废液、 黑废液(造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆)等。 工业上的甲烷发酵主要利用废水、废渣作原料,在我国农村,已推广利用粪便及禾草为原料发酵生产甲烷 作为燃料。 (二)配制培养基的 4 种方法 1.生态模拟

直接取用这类天然基质(经过灭菌)或模拟这类自然条件,就可获得一个“初级的”天然培养基来培养相 应的微生物。 例如,用肉汤、鱼汁来培养细菌; 用果汁来培养酵母菌; 用润湿的麸皮、米糠培养霉菌; 用米饭或面包来培养根霉; 用肥土来培养放线菌; 用玉米芯来培养脉孢菌(Neurosporaspp.)等。 2.参阅文献 (1)直接经验 (2)查阅、分析和利用一切文献资料上的对自己直接或间接有关的信息 3.精心设计 4.试验比较 例如,先在培养皿琼脂平板上测试某微生物的营养要求, 然后作摇瓶培养(shake culture)试验, 再进行台式发酵罐培养试验, 最后才扩大到试验型发酵罐和生产型发酵罐的规模。

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二、培养基的种类 培养基——微生物的菜谱 名目繁多、种类各异 (一)按对培养基成分的了解作分类 (二)按培养基外观的物理状态作分类 (三)按培养基对微生物的功能作分类 (四)发酵工厂的培养基 1. 种子培养基 为了在较短时间内获得数量较多的强壮而整齐的种子细胞,需要使用种子培养基。 种子培养基营养丰富、氮源充足,由于用量不多,原料可使用较为精制的。 2. 发酵培养基 发酵培养基适用于合成发酵产物的培养基。

如果产物分子中以碳元素为主,发酵培养基中碳源含量就需高些,例如谷氨酸产物;如果产物分子中氮 元素较多,氮源也要相应增加。 发酵培养基用量很大,每天都需几十吨,因此要尽量选用成本较低的原料,选原料时还要考虑它对产品 提取、工艺条件的影响。 3. 保藏培养基 保藏培养基一般营养不需丰富 二、 培养基的配制

第五章

微生物的新陈代谢

新陈代谢(metabolism)简称代谢,生物体内一切化学反应和物理反应的总和。 或指发生在活细胞中的各种分解代谢(catabolism)和合成代谢(anabolism)的总和 新陈代谢 = 分解代谢 + 合成代谢 分解代谢又称异化作用,是指复杂的有机物分子通过分解代谢酶系的催化产生简单分子、能量和还原力 的作用。 合成代谢又称同化作用,是指在合成酶系的催化下,由简单分子、 ATP 形式的能量和还原力一起,共 同合成复杂的生物大分子的过程。 根据代谢过程中产生的代谢产物对生物体的作用不同,代谢可分为初级代谢和次级代谢。 初级代谢:把营养物质转变成细胞的结构物质,或对机体具生理活性的物质,或为机体生长提供能量的 物质的一类代谢类型。 初级代谢对生命活动是必须的,它存在于一切生物体内。 初级代谢的产物称为初级代谢产物,具体包括: ① 供机体进行生物合成的各种小分子前体物、单体和多聚体物质,例如丙酮酸、各种氨基酸、核苷酸 等 ② 在能量代谢和代谢调节中起作用的各种物质,例如 ATP。 次级代谢:微生物在一定的生长时期(一般是稳定生长时期) ,以初级代谢产物为前体,合成一些对微 生物的生命活动没有明确功能的物质的过程 次级代谢并不普遍存在于生物界,也不存在于整个生长时期,即次级代谢并非生命活动所必须的。但次 级代谢产物对人类是很重要的,例如抗生素、生长刺激素、色素、生物碱等。 第一节 微生物的能量代谢

一切生命活动都是耗能反应,能量代谢就成了新陈代谢中的核心问题。 研究能量代谢的根本目的,是追踪生物体如何把外界环境中的多种形式的最初能源(primary energy sources)转换成对一切生命活动都能利用的通用能源(universal energy source)------ATP。 一、化能异养微生物的生物氧化和产能

生物氧化(biological oxidation) : 就是发生在活细胞内的一系列产能性氧化反应的总称。 (一)底物脱氢的四条途径 以葡萄糖作为生物氧化的典型底物,它在脱氢阶段主要可通过 4 条途径完成其脱氢反应,并伴随还原力 [H]和能量的产生。 (二)递氢和受氢 贮存在生物体内葡萄糖等有机物中的化学能,经上述的 4 条途径脱氢后,经过呼吸链(或称电子传递链) 等方式传递,最终与氧、无机或有机氧化物等氢受体(hydrogen acceptor 或 receptor)相结合而释放出其中的 能量。 根据递氢特点尤其是氢受体性质的不同,可把生物氧化区分成 3 种类型 。 1. 呼吸作用(respiration) 微生物在降解底物的过程中,将释放出的电子交给 NAD(P)+、FAD 或 FMN 等电子载体,再经电子传 递系统传给外源电子受体,从而生成水或其它还原型产物并释放出能量的过程,称为呼吸作用。 (1)好氧呼吸(aerobic respiration) 是一种最普遍又最重要的生物氧化或产能方式, 其特点是底物脱下的氢经完整的呼吸链传递, 最终被外源分子氧接受, 产生水并释放出 ATP 形式的能量。 这是一种递氢和受氢都必须在有氧条件下完成的生物氧化作用,是一种高效产能方式。 (2)无氧呼吸(anaerobic respiration) 又称厌氧呼吸,是一类呼吸链末端的氢受体为外源无机氧化物(少数为有机氧化物)的生物氧化。其特 点是底物按常规途径脱氢后,经部分呼吸链递氢,最终由氧化态的无机物或有机物受氢,并完成氧化磷酸化 产能反应。 这是一类在无氧条件下进行的、产能效率较低的特殊呼吸。 ① 硝酸盐呼吸(nitrate respiration)又称反硝化作用(denitrification) ② 硫酸盐呼吸(sulfate respiration) ③ 硫呼吸(sulphur respiration) ④ 铁呼吸(iron respiration) ⑤ 碳酸盐呼吸(carbonate respiration) ⑥ 延胡索酸呼吸(fumarate respiration)

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2. 发酵(fermentation)

(1)定义 广义的发酵:泛指任何利用好氧或厌氧微生物来生产有用代谢产物或食品、饮料的一类生产方式。 狭义的发酵: 指在无氧等外源氢受体的条件下, 底物脱氢后所产生的还原力[H]未经呼吸链传递而直接交 某一内源性中间代谢物接受,以实现底物水平磷酸化产能的一类生物氧化反应。 (2)微生物的发酵类型 不同的微生物通过发酵作用,积累的代谢产物是不一样的。根据主要代谢产物将微生物发酵分为以下几 个类型。 ① 乙醇发酵

酒精发酵是最古老的一种发酵,它在化工、医药及食品行业的用途广泛。 NADH2 是 EMP 途径中产生的,用作氢供体还原乙醛,这样 NAD+又可循环使用,使 EMP 途径中有氢 受体。 在乙醇发酵中,1 分子葡萄糖最终可产生 2 分子乙醇,发酵中最关键的酶是丙酮酸脱羧酶。 乙醇发酵对环境条件的变化十分敏感 a.O2 的作用 乙醇发酵需在厌氧条件下进行。如果变成好氧条件,乙醇形成就停止,葡萄糖分解的速度减慢——巴斯 德效应。 巴斯德效应产生的原因 在好氧条件下:(1)丙酮酸脱羧酶失活,丙酮酸脱氢酶作用,TCA (2)大量 ATP 抑制磷酸果糖激酶,葡萄糖分解减慢 b.pH 的作用 乙醇发酵所需的 pH 是弱酸性的,pH3.5~4.5。pH 值控制在微碱性(pH7.6 左右)条件下:酵母的乙醇 发酵甘油发酵,产物主要是甘油和少量的乙醇与乙酸 ——酵母的第三型发酵。 在三型发酵中没有 ATP 产生,所以这种发酵是在静息细胞中进行的。 乙酸的产生会降低培养基的 pH 值,使三型发酵重新回到正常的乙醇发酵,所以,如果产品需要的是甘 油,一定要控制好 pH。 c.培养基成分的作用 在酵母菌进行乙醇发酵的培养基中如果加入亚适量的亚硫酸氢钠,这时乙醇发酵转向甘油发酵,终产物 是大量甘油和少量乙醇,这便是酵母菌的第二型发酵。 这里有少量的乙醇产生是为了维持菌体正常生长提供能量。 如果要利用酵母菌的第二型发酵来生产甘油,则培养基中的一定要亚适量 NaHSO3(3%) ,大量的 NaHSO3 对酵母有毒害作用。 通过酵母的三个类型发酵的分析,可以看出工艺条件对发酵工业的重要性。工艺条件不同,发酵的产品

性质和数量不同,其他类型的发酵也是如此。 例如,味精的生产,即是谷氨酸发酵,在生产中,NH4+的浓度直接影响谷氨酸的产量。 NH4+浓度过 高,产生的谷氨酸进一步转变成谷氨酰胺; NH4+浓度过低,发酵产物不是谷氨酸而是它的前体α -酮戊二 酸。 酒精工业发展趋向 一 利用废料、垃圾来代替淀粉原料,利用纤维素、半纤维素原料生产乙醇是当今研究的一个热点。

二 应用高温耐高酒精度菌种来生产 三 用固定化细胞连续发酵。 四 利用细菌来生产。例如,运动发酵单胞菌,它可利用 ED 途径分解葡萄糖,产生 2 分子丙酮酸,在丙 酮酸脱氢酶的作用下,将丙酮酸裂解为乙醛和 CO2,乙醛还原成乙醇。 周期短、产量高、高糖发酵、耐高酒精度 五 在真空条件下边发酵边蒸馏,使发酵液中酒精浓度始终处于很低水平。 ② 乳酸发酵

乳酸是一种需求量很大的发酵产品。全世界每年乳酸的消费量为 13~15 万吨,我国的乳酸生产量 11000 吨。 乳酸生产现在主要是化学合成,但化学合成法生产的乳酸是 DL-乳酸, 发酵法生产的是 L-乳酸。 目前发酵法生产乳酸的产酸水平普遍在 9~10%,中试报道也达到 12~14%,国外的产酸水平是 18%。 ② 乳酸发酵

乳酸是一种需求量很大的发酵产品。全世界每年乳酸的消费量为 13~15 万吨,我国的乳酸生产量 11000 吨。 乳酸生产现在主要是化学合成,但化学合成法生产的乳酸是 DL-乳酸, 发酵法生产的是 L-乳酸。 目前发酵法生产乳酸的产酸水平普遍在 9~10%,中试报道也达到 12~14%,国外的产酸水平是 18%。 乳酸发酵是由乳酸菌在严格厌氧的条件下进行的。乳酸菌是耐氧型的厌氧菌,G+,无芽孢,有杆菌、球 菌等。乳酸菌生长过程中需要多种生长因子,可分解葡萄糖产生大量的乳酸。 a.同型乳酸发酵 b.异型乳酸发酵 凡葡萄糖发酵后产生乳酸、乙醇(或乙酸)和 CO2 等多种产物的发酵称异型乳酸发酵异型乳酸发酵 (heterolactic fermentation) 。 c.双歧杆菌途径 这是一条在 1960 年代中后期才发现的双歧杆菌(Bifidobacteria)通过 HMP 发酵葡萄糖的新途径。特点 是 2 分子葡萄糖可产 3 分子乙酸、2 分子乳酸和 5 分子 ATP。

乳酸发酵对我们食品工业和酿酒工业来说十分重要。例如,酸乳、泡菜、乳酪、酸奶油等的生产均通过 乳酸发酵。甚至在香肠的制作中也需乳酸菌的参与。但在酿酒工业中乳酸菌是一重大污染菌。 ③ 丁酸发酵与丙酮、丁醇发酵

这类发酵是由专性厌氧菌梭状芽孢杆菌分解葡萄糖进行的。这类型发酵的终产物主要是丁酸、丙酮和丁 醇。在丙酮、丁醇生发酵过程中,pH 要控制在 4.5 以下。 与丁酸发酵相类似的是己酸发酵,丁酰 CoA 经过类似脂肪酸合成途径合成己酰 CoA,再生成己酸。己 酸是一种香型物质,例如,白酒中大曲、特曲四溢的香气。乙酸还可作为食品添加剂。 ④ 混合酸发酵与丁二醇发酵

进行这类发酵的是肠道菌,不同的肠道菌具有不同的酶系来作用于丙酮酸,所以终产物是不同的。 以大肠杆菌为代表的一类肠道菌,例如,埃希氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌等,发酵产物主要是甲酸、乙 酸、乳酸、琥珀酸等有机酸和 CO2、H2,所以称为混合酸发酵。 产气杆菌、枯草杆菌等发酵产物主要是丁二醇,所以称之为丁二醇发酵。 VP 反应: ⑤ 丙酸发酵

丙酸具有与乙醇类似的刺激味,丙酸及其盐类对引起面包产生粘丝状物质的好气性芽孢杆菌有抑制作 用,但对酵母无效,因此国内为广泛用于面包糕点的防腐。 二、自养微生物产 ATP 和产还原力 化能无机自养型微生物(无机物) 光能自养型微生物(日光辐射能) (一)化能自养微生物(chemoautotrophs) 化能自养微生物还原 CO2 所需要的 ATP 和[H]是通过氧化无机底物(例如,NH4+、NO2-、H2S、S0、H2 和 Fe2+等)而获得的。 其产能途径主要也是借助于经过呼吸链的氧化磷酸化反应,化能自养菌一般都是好氧菌。 化能自养微生物产能机制效率低、固定 CO2 要大量耗能,因此他们的产能效率、生长速率和生长得率都 很低。 化能自养微生物的能量代谢的 3 个特点 ① 无机底物的氧化直接与呼吸链发生联系,即由脱氢酶或氧化还原酶催化的无机底物脱氢或脱电子后, 可直接进入呼吸链传递; ② 呼吸链的组分更为多样化,氢或电子可以从任一组分直接进入呼吸链; ③ 产能效率即 P/O 比一般要低于化能异养微生物。 1.硝化细菌(nitrifying bacteria) 是广泛分布于各种土壤和水体中的化能自养微生物。这两类细菌往往伴生在一起,在它们的共同作用下 将铵盐氧化成硝酸盐,避免亚硝酸积累所产生的毒害作用。

这类细菌在自然界的氮素循环中也起者重要的作用,在自然界中分布非常广泛。

1. 循环光合磷酸化(cyclic photophosphorylation) 一种存在于光合细菌(photosynthetic bacteria)中的原始光合作用机制,可在光能驱动下通过电子的循环 式传递而完成磷酸化产能反应。 特 点: ①电子传递途径属循环方式, 即在光能的驱动下, 电子从菌绿素分子上逐出, 通过类似呼吸链的循环, 又回到菌绿素, 其间产生了 ATP; ②产 ATP 与产还原力[H]分别进行; ③还原力来自 H2S 等的无机氢供体; ④不产生氧。 具有循环光合磷酸化的生物,属于原核生物真细菌中的光合细菌,均是厌氧菌,分类上在红螺菌目 (Rhodospirillales) 。 红螺菌目的光合细菌细胞内所含的菌绿素和类胡萝卜素的量和比例不同,可使菌体呈现出红、橙、蓝绿、 紫红、紫或褐等不同颜色。 这是一类典型的水生细菌,广泛分布于缺氧的深层淡水或海水中。 可利用有毒的 H2S 或污水中的有机物(脂肪酸、醇类等)作还原 CO2 时的氢供体,用于污水净化;产 生的菌体可作饵料、饲料或食品添加剂等。 2. 非循环光合磷酸化 (noncyclic photophosphorylation) 这是各种绿色植物、藻类和蓝细菌所共有的利用光能产生 ATP 的磷酸化反应。 特 点: ①电子的传递途径属非循环式的; ②在有氧条件下进行; ③有两个光合系统,其中的 PSⅠ(含叶绿素 a)可以利用红光, PSⅡ(含叶绿素 b)可利用蓝光; ④反应中同时有 ATP(产自 PSⅡ) 、还原力[H](产自 PSⅠ)和 O2(产自 PSⅡ)产生; ⑤还原力 NADPH2 中的[H]是来自 H2O 分子光解后的 H+和 e-。 3. 嗜盐菌紫膜的光介导 ATP 合成 嗜盐菌(halophile 或 halophilic bacteria)在无氧条件下,利用光能所造成的紫膜蛋白上视黄醛(retinal) 辅基构象的变化,可使质子不断驱至膜外,从而在膜两侧建立一个质子动式,由它来推动 ATP 酶合成 ATP, 即光介导 ATP 合成(light-mediated ATP synthesis) 。 这是一种直至 1970 年才发现的、 只在嗜盐菌中才有的无叶绿素或菌绿素参与的独特光合作用。

紫膜 (purple membrane) 紫膜由称作细菌视紫红质 。 (细菌紫膜质, bacteriorhodopsin) 的蛋白质 (占 75%) 和类脂(占 25%)组成,蛋白质与人眼视网膜上柱状细胞中所含的一种功能相似的蛋白——视紫红质 (rhodopsin)十分相似,两者都以紫色的视黄醛作辅基。 有光 ? ? ? 无光 视紫红质 bR 结构 顺式 1 视紫红质 bR 结构 反式 0

第二节

分解代谢和合成代谢的联系

分解代谢与合成代谢在生物体内是偶联进行的,它们之间的关系是对立统一的。 分解代谢与合成代谢的关系图 一、两用代谢途径 凡在分解代谢和合成代谢中均具有功能的代谢途径,称为两用代谢途径(amphibolic pathway) 。 EMP、HMP 和 TCA 循环等都是重要的两用途径。 Eg.葡糖异生作用(gluconeogenesis) 。 ① 在两用代谢途径中,合成途径并非分解途径的完全逆转。 ② 在分解代谢与合成代谢途径的相应代谢步骤中,包含了完全不同的中间代谢物。 ③ 在真核生物中,合成代谢和分解代谢一般在细胞的不同区域中分隔进行;原核生物因其细胞结构上 的间隔程度低,故反应的控制主要在简单的酶分子水平上进行。 二、代谢物回补顺序 代谢物回补顺序(anaplerotic sequence) ,又称代谢物补偿途径或添补途径(replenishment pathway) , 是指能补充两用代谢途径中因合成代谢而消耗的中间代谢物的那些反应。 作用:当重要产能途径中的关键中间代谢物必须被大量用作生物合成的原料而抽走时,仍可保证能量代 谢的正常进行。 不同的微生物种类或同种微生物在不同碳源下,有不同的代谢物回补顺序。与 EMP 途径和 TCA 循环有关 的回补顺序约有 10 条。 乙醛酸循环(glyoxylate cycle) :又称乙醛酸支路(glyoxylate shunt) ,是 TCA 循环的一条回补途径, 可使 TCA 循环不仅具有高效产能功能,而且还兼有可为许多重要生物合成反应提供有关中间代谢物的功能, Eg.草酰乙酸可合成天冬氨酸, α -酮戊二酸可合成谷氨酸,琥珀酸可合成叶卟啉等。 在乙醛酸循环中有两个关键酶——它们可使丙酮酸和乙酸等化合物合成 4C 二羧酸,以保证微生物正常 生物合成的需要。 乙醛酸循环的总反应式:2 丙酮酸→琥珀酸+2CO2 乙醛酸循环中的两个关键反应:

具有乙醛酸循环的微生物, 普遍是好氧菌, 例如可用乙酸作唯一碳源生长的一些细菌, 包括 Acetobacter (醋杆菌属) 、 Azotobacter(固氮菌属) 、 E.coli、 Enterobacteraerogenes(产气肠杆菌) 、 Paracoccusdenitrificans(脱氮副球菌) 、 Pseudomonasfluorescens(荧光假单胞菌) 、 Rhodospirillum(红螺菌属)等; 真菌中的 Saccharomyces(酵母属) 、 Aspergillusniger(黑曲霉) 、 Penicillium(青霉属)等。

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教 203 微生物独特合成代谢途径举例

第三节 自养微生物的 CO2 固定 生物固氮 细胞壁肽聚糖的合成 微生物次生代谢物的合成 一、自养微生物的 CO2 固定

各种自养微生物在其生物氧化磷酸化、发酵和光合磷酸化中获取的能量主要用于 CO2 的固定。 在微生物中 CO2 的固定的 4 条途径: Calvin 循环 厌氧乙酰-CoA 途径 逆向 TCA 循环途径 羟基丙酸途径 (一)Calvin 循环(Calvin cycle) Calvin 循环又称 Calvin-Benson 循环、Calvin-Bassham 循环、核酮糖二磷酸途径或还原性戊糖磷酸循 环。这一循环是光能自养生物和化能自养生物固定 CO2 的主要途径。 核 酮 糖 二 磷 酸 羧 化 酶 ( ribulose biphosphate carboxylase , 简 称 RuBisCO ) 和 磷 酸 核 酮 糖 激 酶

(phosphoribulokinase)是本途径中两种特有的酶。 利用 Calvin 循环进行 CO2 固定的生物包括绿色植物、蓝细菌、多数光合细菌(光能自养型)和硫细菌、 铁细菌、硝化细菌等(化能自养型) 。 如果以产生 1 个葡萄糖分子来计算,则 Calvin 循环的总式为: 6CO2+12NAD(P)H2+18ATP→C6H12O6+12NAD(P)+18ADP+18Pi (二)厌氧乙酰-CoA 途径 (activated acytyl-CoA pathway) 厌氧乙酰-CoA 途径又称活性乙酸途径(activated acetic acid pathway) 。这种非循环式的 CO2 固定 机制主要存在于一些产乙酸菌、硫酸盐还原菌和产甲烷菌等化能自养细菌中。 (三)逆向 TCA 循环(reverse TCA cycle) 自 学

(四)羟基丙酸途径 (hydroxypropionate pathway) 自 学

二、生物固氮 生物固氮(nitrogen-fixing organisms,diazotrophs)是指大气中的分子氮通过微生物固氮酶的催化 而还原成氨的过程,生物界中只有原核生物才具有固氮能力。 自 学

三、微生物结构大分子——肽聚糖的生物合成 肽聚糖是绝大多数原核生物细胞壁所含有的独特成分;它在真细菌的生命活动中有着重要的功能,尤其 是许多重要抗生素例如青霉素、头孢霉素、万古霉素、环丝氨酸(恶唑霉素)和杆菌肽等呈现其选择毒力 (selective toxicity)的物质基础;加之它的合成机制复杂,并在细胞膜外进行最终装配步骤。 四、微生物次生代谢物的合成 自 学

第六章

微生物的生长及其控制

生长和繁殖是保证微生物获得巨大数量的必要前提。 生长(growth) :生物个体物质有规律地、不可逆增加,导致个体体积扩大的生物学过程。 繁殖(reproduction) :生物个体生长到一定阶段,通过特定方式产生新的生命个体,即引起生命个体数 量增加的生物学过程。 生长是一个逐步发生的量变过程,繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。 生长和繁殖在高等生物里这两个过程可以明显分开,但在低等特别是在单细胞的生物里,由于细胞小, 这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。

第一节 测定生长繁殖的方法 微生物生长:单位时间里微生物数量或生物量(Biomass)的变化 微生物生长的测定: 个体计数 群体重量测定 群体生理指标测定 评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响; 评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果; 客观地反映微生物生长的规律; 一、测生长量 测定生长量的方法很多,适用于一切微生物。 (一)直接法 (二)间接法 二、计繁殖数 测定繁殖,一定要一一计算各个体的数目。 (一)计繁殖数直接法 (二)计繁殖数间接法 (一)直接法 测体积法:粗放型,在刻度离心管中测沉降量 称干重法:精确型,离心法和过滤法获得菌体细胞, 微生物的干重一般为其湿重的 10%~20%。 测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法 以 E. coli 为例,一般液体的培养物(culture)中,细胞浓度通常为 2×109 个/mL,100mL 培养物约可 得 10~90mg 干重的细胞; 高密度培养(high cell-density culture,HCDC)中,细胞产量最高记录可达到 174g/L。 (二)间接法 1.比浊法 用分光光度法对无色的微生物悬浮液进行测定,一般选用 450~650nm 波段。 若要连续跟踪某一培养物的生长动态,可用带有侧臂的三角烧瓶作原位测定,即不必取样。 2.生理指标法 微生物的生理指标,如氮、碳、DNA、ATP 等物质的含量,呼吸强度、耗氧量、酶活性、生物热等与其 群体的规模成正相关。 样品中微生物数量多或生长旺盛,这些指标愈明显,因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量

热计等设备来测定相应的指标。 常用于对微生物的快速鉴定与检测 一种特定的微生物,每一个细胞中的 ATP 浓度几乎是一个常数,所以测定这种微生物的 ATP 含量,即 可知其细胞数。 在这个反应系统中,酶、荧光素和 O2 都过量时,光的强度与 ATP 的量成正比。可用生物发光仪测定光 照强度,从而换算出 ATP 的浓度。 生物发光仪现用于各种样品中细胞数的测定。Eg. 临床上测血液、尿液中的菌数;工业上发酵液中的菌 数;环境污染状况的测定等。 (一)繁殖数直接计数法 1. 计数板直接计数法 指采用计数板 (细菌计数板或血球计数板) 在光学显微镜下直接观察微生物细胞并进行计数的方法。 , (计 算一定容积里样品中微生物的数量) 2. 染色后活菌计数法 采用特定的染色技术进行活菌染色,然后用光学显微镜计数的方法。可分别对活菌和死菌进行计数。例: 美蓝 酵母 活细胞→无色 死细胞→蓝色 Eg. 细菌经丫啶橙染色后,在紫外光显微镜下可观察 活细胞→橙色荧光 死细胞→绿色荧光 3.比例计数 将已知颗粒浓度的样品(例如血液)与待测细胞细胞浓度的样品混匀后在显微镜下根据二者之间的比例 直接推算待测微生物细胞浓度。 4.过滤计数 当样品中菌数很低时,可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、 染色,并经处理使膜透明,再在显微镜下计算膜上(或一定面积中)的细菌数。 (二)繁殖数间接计数法 是一种活菌计数法,这是一种依据活菌在液体培养基中会使其变混或在固体培养基上(内)形成菌落的 原理而设计。 最常用的是菌落计数法(colony-counting methods) 。 1. 平板菌落计数法 (1)浇注平板(pour plate)适用于计数,好氧菌 (2)涂布平板(spread plate)此法适用于分离,厌氧菌。 采用培养平板计数法要求操作熟练、准确,

否则难以得到正确的结果。 一个菌落可能是多个细胞一起形成,所以在科研中 一般用菌落形成单位(colony forming units, CFU)来表示, 而不是直接表示为细胞数。 根据每皿上形成的 CFU 数乘上稀释度可推算出菌样的含菌数。 此方法最为常用, 但操作较繁琐且要求操 作者技术熟练——缺点。 国外出现了微型、快速、商品化的用于菌落计数的小型纸片或密封琼脂板。原理是利用加在培养基中的 活菌指示剂 TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑) ,它可使菌落在很微小是就染成易于辨认的玫瑰色。 当样品中菌数很低时,可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器,然后将将膜转到相 应的培养基上进行培养,对形成的菌落进行统计。 3. 厌氧菌的菌落计数法 一般可用亨盖特滚管培养法进行。此法设备较复杂,技术难度很高。

第二节 微生物的生长规律 微生物的特点: 个体微小 肉眼看到或接触到的微生物是成千上万个 单个的微生物组成的群体。 微生物接种是群体接种,接种后的生长是微生物群体繁殖生长。 对细菌群体生长规律的了解是对其进行研究与利用的基础 微生物的个体生长和同步生长 1. 微生物个体细胞的生长 (1)细菌的生长 一个新生的细胞长大到最后分裂为两个子细胞的过程称为细胞周期。在细胞周期内主要的细胞学变化是 细胞的表面生长即细胞壁的增生、DNA 的复制以及细胞分裂成子代细胞。 细菌培养物在培养条件下度过的时间称为细菌的菌龄。 (2)酵母菌的生长 酵母菌主要的繁殖方式是出芽,酵母菌细胞的生长——芽细胞的生长。 酵母菌的细胞周期是两次细胞分裂之间的时间,这个周期分为四个时期: 间隔期 G1、 DNA 合成期 S、 第二间隔期 G2、 有丝分裂期 M.

(3)霉菌的生长 丝状真菌的生长时从孢子萌发开始的,以其菌丝顶端延长的方式进行的。当菌丝伸长到一定程度后就会 出现分枝。

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二、单细胞微生物的典型生长曲线 在微生物学中提到的“生长”,均指群体生长。 生长曲线(Growth Curve) :定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线,称为生长曲线 (growth curve) 。 由于采用活菌计数比较麻烦,并要求严格进行操作,否则不易得到准确的结果,重复性也差,因此在实 际工作中多采用分光光度计测定 OD 值的方法绘制细菌的生长曲线。 细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图 根据微生物的生长速率常数(growthrateconstant) ,即每小时的分裂次数(R)的不同,一般可把典型 生长曲线粗分为延滞期、指数期、稳定期和衰亡期等 4 个时期。 延滞期(Lag phase) 又称停滞期、调整期和适应期。指少量单细胞微生物接种到新鲜培养基后,在开始培养的一段时间内细 胞数目不立即增加,或增加很少,生长速度接近于零的一段时期——代谢系统是正在适应新环境。 1. 延滞期的特点 分裂迟缓、代谢活跃 ① 生长速率常数为零; ② 细胞形态变大或增长,许多杆菌可长成丝状, Eg.巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)在延滞期末,细胞的平均长度比刚接种时长 6 倍; 一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大! ③ 细胞内 RNA 尤其是 rRNA 含量增高,原生质呈嗜碱性; ④ 合成代谢十分活跃,核糖体、酶类和 ATP 合成加速,易产生各种诱导酶; ⑤ 对外界不良条件如 NaCI 溶液浓度、温度和抗生素等理化因素反应敏感。 细胞处于活跃生长中,只是分裂迟缓。 在此阶段后期,少数细胞开始分裂,曲线略有上升。 2. 迟缓期出现的原因 调 整 代 谢

微生物接种到一个新的环境,暂时缺乏分解和催化有关底物的酶,或是缺乏充足的中间代谢产物等。为

产生诱导酶或合成中间代谢产物,就需要一段适应期。 影响延滞期长短的因素很多 (1)菌种的遗传性 (2)接种龄 指接种物或种子(inoculum,复数 inocula)的生长年龄,亦即它处在生长曲线上哪一个阶段时用来作 种子的。这是指某一群体的生理年龄。 种子的接种龄 子代培养物的延滞期 对数期 稳定期 延滞期或衰亡期 (3)接种量 接种量的大小明显影响延滞期的长短。 接种量小 接种量大 延滞期长 延滞期短 短 居中 长

在发酵工业上,缩短延滞期=缩短生产周期,提高发酵效率,一般采用较大的接种量(种子:发酵培养 基=1:10V/V) 。 (4)培养基成分 天然培养基 组合培养基 营养丰富 营养单调 延滞期短 延滞期长

所以,在发酵生产中,常使发酵培养基的成分与种子培养基的成分尽量接近。 3.生产实践中缩短延滞期的常用手段 通过遗传学方法改变种的遗传特性使延滞期缩短; 利用对数生长期的细胞作为种子; 尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大; 适当扩大接种量; 对数生长期(Logarithmic phase ) 又称指数生长期(Exponential phase) 。指在生长曲线中,紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长 的时期 。 对数生长期的特点 ① 生长速率常数 R 最大,因而细胞每分裂一次所需的时间——代时(generation time ,G,又称世代 时间或增代时间)或原生质增加一倍所需的倍增时间(doubling time)最短; ② 细胞进行平衡生长(balanced growth) ,菌体各部分的成分十分均匀;

③ 酶系活跃,代谢旺盛; 对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致,代谢旺盛、生长迅速、代时稳定,所以 是研究微生物基本代谢的良好材料。 在生产上用作种子,使微生物发酵的迟缓期缩短,提高经济效益。 对数生长期的 3 个重要参数 繁殖代数(n) x2=x1·2n n = lgx2–lgx1/ lg2=3.322(lgx2–lgx1)

(2)生长速率常数(R) n 3.322(lgx2–lgx1)

R = ———————— = ———————————————— t2–t1 (3)代时(G) G =1/R = t2–t1/3.322(lgx2–lgx1) 在细菌个体生长里,每个细菌分裂繁殖一代所需的时间为代时(Generation time) ; 在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增时间(Doubling time) 。 影响微生物增代时间(代时)的因素 菌种,不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同; 营养成分,在营养丰富的培养基中生长代时短,反之则长; 凡是处于较低浓度范围内,可影响生长速率的营养物成分,就称为生长限制因子( growyh-limited factor) 。 营养物浓度,营养物的浓度可影响微生物的生长速率和生长总量 ,在一定范围内,生长速率与营养物 浓度呈正比; 培养温度,在一定范围,生长速率与培养温度呈正相关。 纳米细菌(nanobacteria) ,三天才分裂一次; 九十年代初期从地下数公里发现的超微型细菌,用代谢产生的 CO2 作指标,计算出这些超微菌的代谢速率仅为地上正常细菌 的 10-15,有人认为它们需要 100 年才能分裂一次。 稳定期( stationary phase) 又称恒定期或最高生长期。其特点是生长速率常数 R 等于 0,即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相 等,或正生长与负生长相等的动态平衡之中。 这时的菌体产量达到了最高点,而且菌体产量与营养物质的消耗间呈现出一定的比例关系,这一关系就 是生长产量常数 Y(或称生长得率,growth yield) 。 t2–t1

Y = x–x0/ C0–C = x–x0/ C0 x——稳定期时的细胞干重(g/ml 培养液) , x0——刚接种时的细胞干重, C0 ——限制性营养物的最初浓度(g/ml) , C ——稳定期时限制性营养物的浓度(由于计算 Y 时必须用限制性营养物,所以 C 应等于 0) 。 稳定期 细胞重要的分化调节阶段,

(1)细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物; (2)芽孢杆菌在这时开始形成芽孢或建立自然感受态等; (3)有的微生物在稳定期时还开始合成抗生素等次生代谢产物(secondary metabolites)——稳定期产 物(idiolites) 。 生产期以指数期为主的菌体生长期(trophophase) 以稳定期为主的 稳定期到来的原因 ① 营养物尤其是生长限制因子的耗尽; ② 营养物的比例失调,例如 C/N 比值不合适等; ③ 酸、醇、毒素或 H2O2 等有害代谢产物的累积; ④ pH、氧化还原势等理化条件越来越不适宜等。 稳定期对生产实践的指导意义 目的:生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物(SCP、乳酸等) 目的:对维生素、碱基、氨基酸等物质进行生物测定 目的:次生代谢产物 稳定期是最佳生产时期 稳定期是产物的最佳收获期; 代谢产物合成期(idiophase)

稳定期是最佳测定时期;

延长稳定生长期的方法: 生产上常通过补充营养物质(补料)或取走代谢产物、调节 pH、调节温度、对好氧菌增加通气、搅拌或 振荡等措施延长稳定生长期,以获得更多的菌体物质或积累更多的代谢产物。 衰亡期( decline phase 或 death phase) 在衰亡期中,个体死亡的速度超过新生的速度,整个群体呈现负生长状态(R 为负值) 。 细胞形态发生多形化,例如会发生膨大或不规则的退化形态; 有的微生物因蛋白水解酶活力的增强而发生自溶(autolysis) ; 有的微生物在这一期合成或释放对人类有益的抗生素等次生代谢产物; 在芽孢杆菌中,芽孢释放等。 产生衰亡期的原因:外界环境对继续生长越来越不利,Eg.营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累等, 从而引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢,继而导致菌体死亡。 该时期死亡的细菌以对数方式增加,但在衰亡期的后期,由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率

降低,仍有部分活菌存在。 不同的微生物或同一种微生物对不同物质的利用能力是不同的。 有的物质可直接被利用( Eg.葡萄糖或 NH 4+等)——称为速效碳源(或氮源) ;有的需要经过一定的适 应期后才能获得利用能力( Eg.乳糖或 NO3-等)——称为迟效碳源(或氮源) 。 当培养基中同时含有这两类碳源(或氮源)时,微生物在生长过程中会形成二次生长现象。 同步培养(Synchronous culture):使群体中的细胞处于比较一致的,生长发育均处于同一阶段上,即 大多数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法。 同步生长:以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段,并同时进行分裂的生长。通过同步培养方 法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物 离心方法 机械方法 过滤分离法 硝酸纤维素滤膜法 温度 环境条件控制技术 培养基成份控制 其他(如光照和黑暗交替培养) 同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子,它是一种理 想的材料。 硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法 同步生长往往只能维持 2-3 个世代,随后又逐渐转变为随机生长。 微生物的连续培养:将微生物置于一定容积的培养基中,经过培养生长,最后一次收获。 分批培养(batch culture)or 密闭培养(closed culture) :培养基一次加入,不予补充,不再更换。 连续培养(Continous culture ) :又称开放培养(open culture) ,在微生物的整个培养期间,通过一 定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。 培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。 (一)恒浊连续培养 控制连续培养的方法 恒化连续培养 保持恒定的流速 恒浊连续培养 恒浊器(turbidostat)是一种根据培养器内微生物的生长密度,并借光电控制系统来控制培养液流速, 以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。 不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定

测定所培养微生物的光密度值 自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速 使培养物维持在某一恒定浊度 当培养室中的浊度超过预期数值时,流速加快,使浊度降低; 当培养室中的浊度低于预期数值时,流速减慢,使浊度升高; 恒浊培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的 如果所用培养基中有过量的必需营养物,就可以使菌体维持最高的生长速率。 (二)恒化连续培养 恒化器(chemostat 或 bactogen)是一种设法使培养液流速保持不变,并使微生物始终在低于其最高生 长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置。它通过控制某一种营养物的浓度,使其始终成为生长限制 因子的条件下达到的,因而可称为外控制式的连续培养装置。 使培养液流速保持不变,并使微生物始终在低于其最高 生长速率下进行生长繁殖。 一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业 通过控制流速可以得到生长速率不同但密度基本恒定的培养物 遗传学:突变株分离;多用于科研 生理学:不同条件下的代谢变化; 生态学:模拟自然营养条件建立实验模型; 连续发酵与单批发酵相比的优点: ①缩短发酵周期,提高设备利用率; ②便于自动控制; ③降低动力消耗及体力劳动强度; ④产品质量较稳定; 缺点:杂菌污染和菌种退化 培养基一次加入,不予补充,不再更换 四、微生物的高密度培养 微生物的高密度培养(high cell-density culture,HCDC)也称高密度发酵,一般是指微生物在液体 培养中细胞群体密度超过常规培养 10 倍以上时的生长状态或培养技术。 现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌(尤其是 E. coli)生产多肽类药物的实践中逐步发展起来 的。 Eg. 人生长激素、胰岛素、白细胞介素类和人干扰素等。 提高菌体培养密度,提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量) ,可减少培养容器的体积、 培养基的消耗和提高“下游工程”(down-stream processing)中分离、提取的效率,还可缩短生产周期、

减少设备投入和降低生产成本,具有重要的实践价值。 高密度培养的具体方法: (1)选取最佳培养基成分和各成分含量。 (2)补料,这是工程菌高密度培养的重要手段之一。 (3)提高溶解氧的浓度,提高好氧菌和兼性厌氧菌培养时的溶氧量也是高密度培养的重要手段之一。 (4)防止有害代谢产物的生成。

第三节 微生物的六大类营养要素 物理因素:温度、pH 和氧气(最主要) 一、温度

影响微生物生长的主要因素

温度是影响微生物细胞生长和存活的最重要的因素之一。 影响酶的活性 微生物生长速度与温度的关系 最低生长温度 最适生长温度 最高生长温度 对某一具体微生物来说,其生长温度的宽和窄与它们长期进化过程中所处的生存环境温度有关。 例如,一些生活在土壤中的芽孢杆菌,属宽温微生物(15~65℃) ;

E. coli 既可在人体大肠中生活,也可在体外环境中生活,故也是宽温微生物(10~47.5℃) ;
专性寄生在人体泌尿生殖道中的 Neisseriagonorrhoeae 淋病奈瑟氏球菌) ( 则是窄温微生物 (36~40℃) 。 最低生长温度:微生物能够生长繁殖的最低温度。 低于最低生长温度菌体死亡? 低温:保存菌种 最适生长温度:最适生长温度(optimum growth temperature)简称最适温度,是指某菌分裂代时最短 或生长速率最高时的培养温度。 强调指出:对同一微生物来说,最适温度并非一切生理过程的最适温度。即,最适温度并不等于生长得 率最高时的培养温度,不等于发酵速率或累积代谢产物最高时的培养温度,更不等于累积某一代谢产物量最 高时的培养温度。

菌名

生长温度/℃ 发酵温度/℃ 累积产物温度/℃

Serratia

marcescens
37

??㏒ ? ?? 琰 茞 ? ?? ??㏒ 37 ? ?? 琰 茞 ? ??

合成灵杆菌素 20~25

(粘质赛氏杆菌)

Aspergillus niger
(黑曲霉)

产糖化酶 32~34

Streptococcus thermophilus
(嗜热链球菌) 37 47 37

Streptococcus lactis
34 (乳酸链球菌) 这一规律对指导发酵生产有着重要的意义。 40

产细胞:25~30 产乳酸:30

例如,国外曾报道在 Penicillium chrysogenum(产黄青霉)总共 165 小时的青霉素发酵过程中,运用 了上述规律,即根据不同生理代谢过程的温度特点分四段控制其培养温度。 0 小时-→5 小时-→40 小时-→125 小时-→165 小时 结果,其青霉素产量比常规的自始至终进行 30℃恒温培养的对照组提高了 14.7%。 最高生长温度:微生物能够生长繁殖的最高温度。 高于最高生长温度菌体死亡?高温:杀菌 二、氧气 氧对微生物的生命活动有着极其重要的影响。按照微生物与氧的关系,可把它们分成好氧微生物(好氧 菌,aerobes)和厌氧微生物(厌氧菌,anaerobes)两个大类,可进一步细分为 5 类。 1.专性好氧菌(obligate or strict strictaerobe) 必须在较高浓度分子氧(~0.2 巴)的条件下才能 生长, 它们有完整的呼吸链,以分子氧作为最终氢受体, 含有超氧化物歧化酶(superoxide dismutase , SOD)和过氧化氢酶(catalase) 。 绝大多数真菌和许多细菌、放线菌都是专性好氧菌, 例如,Acetobacter(醋杆菌属) 、

Azotobacter(固氮菌属) 、 Pseudomonas aeruginosa(铜绿假单胞菌,又称绿脓杆菌) 、 Coeynebacterium diphtheriae(白喉棒杆菌)等。
2. 兼性厌氧菌(facultative anaerobes)

是以在有氧条件下的生长为主也可兼在厌氧条件下生长的微生物,有时也称 “兼性好氧菌” (facultative aerobes) 。它们能在有氧时靠呼吸产能;无氧时借发酵或无氧呼吸产能,细胞含 SOD 和过氧 化氢酶。 许多酵母菌和不少细菌都是兼性厌氧菌。 例如,Saccharomy cescerevisiae(酿酒酵母) 、

Bacillus licheniformis(地衣芽孢杆菌) 、
肠杆菌科的各种细菌包括 E.coli、

Enterobacteraerogenes(产气肠杆菌,旧称产气气杆菌或产气杆菌) 、 Proteusvulgaris(普通变形杆菌)等。
3. 微好氧菌(microaerophilic bacteria) 只能在较低的氧分压(0.01~0.03 巴,正常大气中的氧分压为 0.2 巴)下才能正常生长的微生物。也是 通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能。 例如,Vibrio cholerae(霍乱弧菌) 、

Hydrogenomonas(氢单胞菌属) 、 Zymomonas(发酵单胞菌属)
和 Campylobacter(弯曲菌属)等。 4. 耐氧菌(aerotolerant anaerobes) 即耐氧性厌氧菌的简称。 是一类可在分子氧存在下进行发酵性厌氧生活的厌氧菌。它们的生长不需要任何氧,但分子氧对它也无 毒害。它们不具有呼吸链,仅依靠专性发酵和底物水平磷酸化而获得能量。耐氧机制是细胞内存在 SOD 和过 氧化物酶,但缺乏过氧化氢酶。 一般的乳酸菌多数是耐氧菌, 例如,Streptococcus lactis(乳链球菌) 、

S.faecalis(粪链球菌) 、 Lactobacillus lactis(乳酸乳杆菌) 、 Leuconostoc mesenteroides(肠膜明串珠菌)等;
非乳酸菌类耐氧菌, 例如,Butyribacterium rettgeri(雷氏丁酸杆菌)等。 5. 厌氧菌(anaerobes) 一般厌氧菌 严格厌氧菌(专性厌氧菌, strict or obligate anaerobes) 特点:

① 分子氧对它们有毒,即使短期接触也会抑制甚至致死; ② 在空气或含 10%CO2 的空气中,它们在固体或半固体培养基的表面上不能生长,只有在其深层的无 氧或低氧化还原势的环境下才能生长; ③ 生命活动所需能量是通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵等提供; ④ 细胞内缺乏 SOD 和细胞色素氧化酶,大多数还缺乏过氧化氢酶。 常见的厌氧菌有 Clostridium(梭菌属) 、

Bacteroides(拟杆菌属) 、 Fusobacterium(梭杆菌属) 、 Bifidobacterium(双歧杆菌属) 、
以及各种光合细菌和产甲烷菌(methanogens)等。 1971 年在 McCord 和 Fridovich 提出关于专性厌氧生活的超氧化物歧化酶(SOD)学说。 SOD 的功能:保护好氧菌不受超氧化物阴离子自由基的毒害,从而提出了缺乏 SOD 的微生物必然只能进 行专性厌氧生活的学说。 按 SOD 分子中所含金属辅基的不同,可把它分为 3 类: SOD 分子中所含 类型 金属辅基 存在的范围



Cu、Zn

几乎所有的真核生物的细胞质中



Fe

原核生物

③ 三、pH

Mn

真核生物的线粒体中

pH 值表示某水溶液中氢离子浓度的负对数值。 纯水呈中性, 其氢离子浓度为 10-7mol/L, 定其 pH 值为 7。 最低生长 pH 最适生长 pH 最高生长 pH 凡其最适生长 pH 值偏于碱性范围内的微生物, 嗜碱微生物(basophile) 耐碱微生物(basotolerant microorganism) 生长 pH 值偏于酸性范围内的微生物也有两类, 嗜酸微生物(acidophile)

耐酸微生物(acidotolerant microorganism) 不同种类微生物有其最适生长 pH 值,同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理、生化过程,也 有不同的最适 pH 要求。对发酵生产中 pH 的控制最为重要。许多抗生素的生产菌也有同样的情况。 微生物细胞内环境中的 pH 相当稳定,一般都接近中性。可免除了 DNA、ATP、菌绿素和叶绿素等重要成 分被酸破坏,或 RNA、磷脂类等被碱破坏的可能性。 胞内酶的最适 pH 一般也接近中性,而周质空间中的酶和胞外酶的最适 pH 则接近环境的 pH。pH 除了对 细胞发生直接影响之外,还对细胞产生不同的间接影响,例如,影响培养基中营养物质的离子化程度,从而 影响微生物对营养物质的吸收, 影响环境中有害物质对微生物的毒性, 以及影响代谢反应中各种酶的活性等。 微生物的生命活动过程中也会能动地改变外界环境的 pH,这就是通常遇到的培养基的原始 pH 在培养微 生物过程中会时时发生改变的原因。 上述变酸与变碱两种过程,在一般培养过程中往往以变酸占优势,因此,随着培养时间的延长,一般培 养基会变得较酸。 上述过程与培养基的组分尤其是碳氮比有极大的关系, 碳氮比高的培养基,例如培养各种真菌的培养基,经培养后其 pH 值常会明显下降; 碳氮比低的培养基,例如培养一般细菌的培养基,经培养后,其 pH 值则常会明显上升。 在微生物培养过程中,一项重要措施——如何及时调节合适的 pH。

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2004.4.21

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教 203 第四节 微生物培养法概论

一个良好的微生物培养装置的基本条件是:按微生物的生长规律进行科学的设计,能在提供丰富而均匀 营养物质的基础上,保证微生物获得适宜的温度和良好通气条件(只有少数厌氧菌例外) ,此外,还要为微 生物提供一个适宜的物理化学条件和严防杂菌的污染等。 微生物培养技术的发展特点: ① 从少量培养发展到大规模培养; ② 从浅层培养发展到厚层(固体制曲)或深层(液体搅拌)培养; ③ 从以固体培养技术为主发展到以液体培养技术为主; ④ 从静止式液体培养发展到通气搅拌式的液体培养; ⑤ 从单批培养发展到连续培养以至多级连续培养; ⑥ 从利用分散的微生物细胞发展到利用固定化的细胞集团; ⑦ 从单纯利用微生物细胞到利用动、植物细胞进行大规模培养; ⑧ 从利用野生型菌种发展到利用变异株甚至遗传工程菌株; ⑨ 从单菌发酵发展到混菌发酵; ⑩ 从低密度培养发展到高密度培养(high cell-density culture,HCDC) ;

? 从人工控制的发酵罐到多传感器、计算机在线控制的自动化发酵罐等; 微生物的培养方法可分为八个大类 (一)固体培养法 1. 好氧菌的固体培养 试管斜面(test-tube slant) 培养皿琼脂平板(agar plate) 克氏扁瓶(kolle flask) 茄子瓶 2. 厌氧菌的固体培养 厌氧菌固体培养的具体方法 (1)高层琼脂柱 (2)厌氧培养皿 (3)亨盖特滚管技术(hungate roll-tube technique) (4)厌氧罐(anaerobic jar) (5)厌氧手套箱(anaerobic glove box) (二)液体培养法 1.好氧菌的液体培养 大多数微生物都是好氧菌,微生物一般只能利用溶于水中的氧,要保证在培养液中始终有较高的溶解氧 浓度。 一般情况下(1 大气压, 20℃ )下,氧在水中的溶解度仅为 6.2ml/L(0.28mmol) ,这些氧只能保证 氧化 8.3mg(即 0.046mmol)葡萄糖,仅相当培养基中常用葡萄糖浓度的 1‰。氧的供应始终是好氧菌生长、 繁殖中的限制因子。 一般可通过增加液体与氧的接触面积或提高氧分压来提高溶氧速率,具体措施有: ① 浅层液体静止培养; ② 将三角瓶内培养物利用往复式或旋转式摇床(shaker)作摇瓶培养(shake-flask cultivation) ; ③ 在深层液体培养器的底部通入加压空气,并用气体分布器使其均匀、密集的微小气泡; ④ 对培养液进行机械搅拌,并在培养器的壁上设置阻挡装置等。 实验室中常用的好氧菌培养法 (1)试管液体培养 (2)三角瓶浅层液体培养 (3)摇瓶培养 (4)台式发酵罐(benchtop fermentor) 2.厌氧菌的液体培养

实验室中对厌氧菌进行液体培养时,保证培养基的氧化还原电位(Eh)降至-150mV~-420mV ,以适合 严格厌氧菌的生长。 二、生产实践中培养微生物的装置 (一)固体培养法 1. 好氧菌的曲法培养 原始的曲法培养就是将麸皮、碎麦或豆饼等固态基质经蒸煮和自然接种后,薄薄的铺在培养容器表面, 使微生物既可获得充足的氧气,又可利于散发热量,对真菌来说,还十分有利于产生大量孢子。 曲(qu 或 mouldy bran) 根据制曲的容器形状和规模的大小分类 瓶曲 袋曲(用塑料袋制曲) 盘曲(用木盘制曲) 帘子曲(用竹帘子制曲) 转鼓曲(用大型木质空心转鼓横向转动制曲) 通风曲(厚层制曲) 机械化程度和生产效率较高的现代化制曲技术,酱油酿造业广泛使用。 2.厌氧菌的堆积培养法 生产实践上对厌氧菌进行大规模固体培养的例子还不多见。在白酒生产中,一向用大型深层地窖对固态 发酵料进行堆积式固态发酵,这对酵母菌的酒精发酵和己酸菌的己酸发酵等都十分有利,可生产名优大曲酒 (蒸馏白酒) 。 (二)液体培养法 1.好氧菌的培养 浅盘培养(shallow pan cultivation) 深层液体通气培养 生产实践上对厌氧菌进行大规模固体培养的例子还不多见。在白酒生产中,一向用大型深层地窖对固态 发酵料进行堆积式固态发酵,这对酵母菌的酒精发酵和己酸菌的己酸发酵等都十分有利,可生产名优大曲酒 (蒸馏白酒) 。 (1)高层琼脂柱 把含有还原剂的固体或半固体培养基装入试管中,经灭菌后,除表层上有一些溶解氧外,越是深层,其 氧化还原势越低,故有利于厌氧菌的生长。 例如,韦荣氏管(Veillon tube)是由一根长 25cm、内径 1cm,两端可用橡皮塞封闭的玻璃管,可作稀释、 分离厌氧菌并对其进行菌落计数。 (2)厌氧培养皿

Ⅱ 利用特制皿底——有两个相互隔开的空间,其一放焦性没食子酸,另一则放 NaOH 溶液,待在皿盖 平板上接入待培养的厌氧菌后,立即密闭之,经摇动,使两试剂接触而发生吸氧反应,从而造成无氧环境, (3)亨盖特滚管技术(hungate roll-tube technique) 由著名美国微生物学家 R.E.Hungate 于 1950 年分离瘤胃微生物和产甲烷菌等严格厌氧菌时设计的一种 具有划时代意义的严格厌氧技术——亨盖特滚管技术(Hungate roll-tube technique) 。 其主要原理:利用除氧铜柱来制备无氧的氮气 普通氮气 通过高温下铜柱,Cu 吸收 O2 无氧的氮气 用无氧氮驱除小环境中的空气,使培养基的配制、分装、灭菌和贮存,以及菌种的接种、培养、观察、 分离、移种和保藏等过程始终处于高度无氧条件下,从而保证了这类严格厌氧菌的存活。 用 这 种 方 法 制 备 成 的 培 养 基 称 为 预 还 原 无 氧 灭 菌 培 养 基 ( PRAS 培 养 基 , pre-reducedanaerobicallysterilizedmedium) 。 (4)厌氧罐(anaerobic jar) 这是一种常规的但不很严格的厌氧菌培养技术,原因是它除能保证厌氧菌在培养过程中处于良好的无氧 环境外,无法使培养基配制、接种、观察、分离、保藏等操作也不接触氧气。 (5)厌氧手套箱(anaerobic glove box) 把含有还原剂的固体或半固体培养基装入试管中,经灭菌后,除表层上有一些溶解氧外,越是深层,其 氧化还原势越低,故有利于厌氧菌的生长。 (1)试管液体培养 装液量可多可少。此法的通气效果不够理想,仅适合培养兼性厌氧菌。 (2)三角瓶浅层液体培养 在静止状态下,三角瓶内的通气状况与其中装液量和棉塞通气程度对微生物的生长速度和生长量有很大 的关系。此法一般也仅适宜培养兼性厌氧菌。 (3)摇瓶培养 又称振荡培养,一般将三角瓶内培养液的瓶口用 8 层纱布包扎,以利通气和防止杂菌污染,同时减少瓶 内装液量,把它放到往复式或旋转式摇床上作有节奏的振荡,以达到提高溶氧量的目的。此法是荷兰的 A. J. Kluyver 等在 1933 年最早试用,目前广泛地用于菌种的筛选以及进行生理、生化发酵和生命科许多领域的研 究工作。 (4)台式发酵罐(benchtop fermentor) 这是一种利用现代高科技制成的实验室研究用的发酵罐,体积一般为数升至数十升,有良好的通气、搅 拌及其他各种必要装置,并有多种传感器(sensor) 、自动记录和用计算机的调控装置。现成的商品种类很多, 应用较为方便。

(1)浅盘培养(shallow pan cultivation) 这是一种用大型的盘子对好氧菌进行浅层液体静止培养的方法。在早期青霉素和柠檬酸等发酵中,均使 用过浅盘培养。 缺点:劳动强度大、生产效率低和产品易污染等,难以推广。 (2)深层液体通气培养 这是一类应用大型发酵罐进行深层液体通气搅拌的培养技术,它的发明在微生物培养技术发展史上具有 革命性的意义,并成为现代发酵工业的标志。 发酵罐(fermenter 或 fermentor)是一种最常规的生物反应器(bioreactor) ,一般是钢质圆筒形直立容器, 其底和盖为扁球形的,高与直径之比一般为 1∶2~2.5。容积可大可小,大型发酵罐的容积在 50~500m3, 最大的为英国用于甲醇蛋白生产的巨型发酵罐,其有效容积达 1500m3。 发酵罐的主要作用是要为微生物提供丰富而均匀的养料,良好的通气和搅拌,适宜的温度和酸碱度,并 能确保防止杂菌的污染。为此,除了罐体有合理的结构(图 7-17)外,还要有一套必要的附属装置,例如培 养基配制系统,蒸气灭菌系统,空气压缩和过滤系统,以及发酵产物的后处理系统[俗称“下游工程” (down-streamprocessing)]等。

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教 307 第五节 有害微生物的控制

控制(有害)微生物的生长速率 消灭不需要的微生物, 在实际应用中具有重要的意义。 一、几个基本概念 抑制(Inhibition):生长停止,但不一定死亡; 防腐(Antisepsis):防止或抑制霉腐微生物在食品等物质上的生长; 化疗(Chemotherapy):杀死或抑制宿主体内的病原微生物; 死亡(Death):生长能力不可逆丧失; 消毒(Disinfection):杀死或灭活病原微生物(营养体细胞) ; 灭菌(Sterilization):杀死包括芽孢在内的所有微生物; 控制有害微生物主要有以下几种措施: 理化因子抑菌还是杀菌作用的相关因素: 理化因子的强度或浓度; 同一浓度理化因子作用时间的长短; 不同种类的微生物;

同种微生物的不同生长时期; (一)灭菌(sterilization) 采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施,称为灭菌。 Eg. 高温灭菌、辐射灭菌等 死亡:微生物永远丧失其生长繁殖能力 消 除 毒 害“毒害”就是指传染源或致病菌 (二)消毒是一种采用较温和的理化因素,仅杀死物体表面或内部一部分对人体或动、植物有害的病原 菌,而对被消毒的对象基本无害的措施。 Eg. 对皮肤、水果、饮用水进行药剂消毒的方法; 对啤酒、牛奶、果汁和酱油等进行消毒处理的巴氏消毒法,等等。 (三)防腐(antisepsis) 防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖,即通过制菌作用防止食品、生物制品等对 象发生霉腐的措施。 防腐的措施 (1)低温 (2)缺氧 (3)干燥 (4)高渗 (5)高酸度 (6)高醇度 (7)防腐剂 (四)化疗(chemotherapy) 化疗即化学治疗,指利用具有高度选择毒力(selective toxicity )即对病原菌具有高度毒力而对宿 主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖,借以达到治疗该宿主传染病的一种措施。 用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂(chemotherapeutant) 。最重要的化学治疗剂如磺胺类等化学合 成药物、抗生素、生物药物素和若干中草药中的有效成分等。 二、物理灭菌因素 杀灭或抑制微生物的物理因素 温度 辐射作用 过滤 渗透压 干燥

超声波等 Ⅰ 温度 当温度超过微生物生长的最高温度或低于生长的最低温度都会对微生物产生杀灭作用或抑制作用 (一)高温杀菌作用的种类 高温使蛋白质、核酸等重要生物大分子发生变性、破坏,以及破坏细胞膜上的类脂成分,导致微生物死 亡。 1.干热灭菌法(dry heat sterilization) 灼烧(incineration 或 combustion)是一种最彻底的干热灭菌方法,其破坏力很强,故应用范围仅限 于接种环、接种针的灭菌或带病原菌的材料、动物尸体的烧毁等。 将金属制品或清洁玻璃器皿放入电热烘箱内,在 150~170℃下维持 1~2 小时后,即可达到彻底灭菌的 目的。 干热 细胞膜破坏 蛋白质变性 原生质干燥 各种细胞成分发生氧化 2.湿热灭菌法(moist heat sterilization) 湿热灭菌法是指用 100℃以上的加压蒸汽进行灭菌。 湿热比干热灭菌更好: 湿热蒸气透射力强,更易于传递热量; 更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构; 湿热对一般营养体和孢子的杀灭条件: 多数细菌和真菌的营养细胞:在 60℃左右处理 5-10 分钟; 酵母菌和真菌的孢子:用 80℃以上温度处理; 细菌的芽孢:121℃处理 15 分钟以上; (1)常压法 1)巴斯德消毒(pasteurization) 60-85℃处理 15s~30min——低温湿热消毒法 低温维持法(LTH,low temperature holding method) 在 63℃下保持 30min 可进行牛奶消毒 高温瞬时法(HTST,high temperature short time) 牛奶消毒时只要在 72℃下保持 15 秒钟即可 巴氏消毒法专用于牛奶、 啤酒、 果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液态风味食品或调料的低温消毒方法。

可杀灭物料中无芽孢的病原菌(如牛奶中的结核杆菌或沙门氏菌) ,而又不影响它们的风味,但不能杀灭引 起 Q 热的病原体——Coxiellaburnetii(伯氏考克斯氏体,是一种立克次氏体) 。 2)煮沸消毒 100 ℃处理 15~30min 一般用于饮用水的消毒 3)间歇灭菌(fractional sterilization 或 tyndallization) 80~100 ℃下蒸煮 15~60min,室温或 37℃下保温过夜,循环三次 又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。 例如,培养硫细菌的含硫培养基用间歇灭菌法灭菌,其内所含元素硫在 99~100℃的温度下可保持正常 结晶形,而常规的加压灭菌(121℃)后会引起硫熔化。 (2)加压法 1)常规加压蒸汽灭菌法(normalautoclaving) 121℃ 115℃ 15~20min; (压力为 0.1MP 35min; ( 0.07MP 1kg/cm2 或 15 磅/英寸 2) ,

0.7kg/cm2 或 10 磅/英寸 2)

一般称作“高压蒸汽灭菌法”。这是一种利用高温(而非压力)进行湿热灭菌的方法。 优点是操作简便、效果可靠,广泛使用。 高压蒸汽灭菌法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的 灭菌 。 5)连续加压蒸汽灭菌法(continuous autoclaving ) 135~140℃,5-15s,工业上发酵培养基 135~150℃,2-6s,牛奶或其它液态食品 (超高温灭菌) 在发酵行业里也称“连消法”。此法只在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。主要操作是将培养基在 发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却,然后才进入发酵罐。 利用温度进行杀菌的定量指标 (1)热致死时间(thermal death time) 指在某一温度下,杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最短时间。 Eg. E. coli 在 60℃下为 10min;Salmonella typhi(伤寒沙门氏菌)在 58℃下为 30min 等。 (2)热死温度(thermal death point) 也称热死点,指在一定时间内(一般为 10min) ,杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最低温度。 Eg. Agrobacterium tumefaciens(根癌土壤杆菌)为 53℃;

Erwinia carotovora (胡萝卜软腐欧文氏菌)为 48~51℃等 。
(二)影响加压蒸汽灭菌效果的因素

1.杀菌物体含菌量 不同的微生物个体(包括营养体和孢子)的耐热性是有差别的。一般灭菌物体中的含菌量越高,需要的 灭菌时间越长。 2.灭菌锅内空气排除程度 在一切利用加压蒸汽灭菌法的场合下,必须做到彻底排除灭检验空气是否排尽最好的办法: 灭菌锅上同时装有压力表和温度计 菌锅内的残余空气 。 3.灭菌对象的 pH pH6.0~8.0 时,微生物较不易死亡; pH<6.0 时,最易引起死亡。 4.灭菌对象的体积 灭菌对象体积的大小会影响热的传导速率。在实验室工作中,对大容量培养基灭菌时,必须注意相应延 长灭菌时间。 5.加热与散热速度 根据季节的变化或灭菌物件体积的大小,确定相应的“上磅”(预热速度)或“下磅”(散热)时间。 4.灭菌对象的体积 5.加热与散热速度 根据季节的变化或灭菌物件体积的大小,确定相应的“上磅”(预热速度)或“下磅”(散热)时间。 (三)高温对培养基成分的有害影响及其防止 1.有害影响 高温,尤其是长时间的高温除对培养基中的淀粉成分有促进糊化和水解等少数有利影响外,一般对培养 基成分产生很多不利的影响。 产生褐变的机制 由氨基化合物 (氨基酸、 蛋白质) 肽、 与羰基化合物 (糖类) 间发生复杂的梅拉特反应 (maillard reaction) 所引起,它在导致培养基褐变的同时,还降低了有关营养物成分,应尽量设法避免。 对易破坏的含糖培养基进行灭菌时,应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并; 对含 Ca2+或 Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌,再混合,不易形成磷酸盐沉淀; 对含有在高温下易破坏成分的培养基(如含糖组合培养基)可进行低压灭菌(在 112℃即 0.57kg/cm2 或 8 磅/英寸 2 下灭菌 15 分钟)或间歇灭菌; 在大规模发酵工业中,可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌等。 (2)过滤除菌法 对培养液中某些不耐热的成分可采用过滤除菌法“灭菌”。其缺点是无法滤除液体中的病毒和噬菌体。 (3)其他方法

加入 0.01%EDTA(乙二胺四乙酸)或 0.01%NTA(氮川三乙酸)等螯合剂到培养基中,可防止金属离子 发生沉淀; 还可以用气体灭菌剂如氧化乙烯(环氧乙烷)等对个别成分进行灭菌处理,在混入以灭过菌的其它培养 基成分中。 2.防止法 Ⅱ 辐射作用 辐射灭菌(Radiation Sterilization)是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一 种有效方法。 Ⅲ 过滤作用 各种滤器(filter) 例如,滤膜过滤装置、 烧结玻璃滤板过滤器、 石棉板过滤器(Seitz filter) 、 素烧瓷过滤器(Chamberland candle) 、 硅藻土过滤器(Berkefeld candle)等。 Ⅳ 高滲、干燥、超声波等 抗微生物剂抗性强弱的指标 1.最低抑制浓度(minimum inhibitory concentration (MIC):评定某化学药物药效强弱的指标, ) 指:在一定条件下,某化学药剂抑制特定微生物的最低浓度 2.半致死剂量(50% lethal dose,LD50) 评定某化学药物毒性强弱的指标, 指:在一定条件下,某化学药剂杀死 50%试验动物的剂量 3.最低致死剂量(minimum lethal dose,MLD) 评定某化学药物毒性强弱的指标, 指:在一定条件下,某化学药剂引起试验动物 100%死亡的最低剂量 (一)防腐剂和消毒剂 特点:对一切活细胞都有毒性,不能用于人或动物体内的化学治疗。 表面消毒剂(surface disinfactant)表面消毒剂是指对一切活细胞都有毒性,不能用作活细胞或机体 内治疗用的化学药剂。 共同规律: 当表面消毒剂处于低浓度时,常常会对微生物的生命活动起刺激作用,随着浓度逐渐增高,就相继出现 制菌和杀菌作用,因而形成一个连续的作用谱。 各种抗微生物化学制剂杀菌能力的比较标准:

在临床上最早使用的消毒剂——石炭酸 石炭酸系数(phenol coefficient,P.C.) : 指在一定时间内,被试药剂能杀死全部供试菌(test organism)的最高稀释度与达到同效的石炭酸的 最高稀释度的之比。一般规定处理时间为 10 分钟,而供试菌定为 Salmonella typhi(伤寒沙门氏菌) 。 广泛用于一些热敏感的或无法进行高温灭菌的物品或场所的灭菌: 温度计、带有透镜的仪器设备、聚乙烯管或导管等; 墙壁、楼板与仪器设备等表面和自来水; 空气; 非典型肺炎 消毒与防治篇 消毒篇 1.过氧乙酸(Peracetic Acid)别名过醋酸、过氧醋酸、PAA,一种速效、高效灭菌剂,可以杀灭细菌、 霉菌、真菌、藻类、病毒、以及细菌芽孢,并能破坏细菌毒素、HBsAg 等。 优点:杀菌作用比过氧化氢强,杀芽孢作用迅速,降解后的最终产物为氧和水,无毒无害。 强氧化剂,具有腐蚀性! 过氧乙酸的合成原料:冰醋酸、硫酸、过氧化氢 防非典 怎样使用过氧乙酸消毒 一是浸泡: 通常纺织品用浓度为 0.04%的溶液浸泡2小时; 餐具洗净后用 0.5%的溶液浸泡 30~60 分钟; 体温计用 0.5%溶液浸泡 15~30 分钟; 病人排泄物容器(便器、痰盂)用 0.5%的溶液浸泡5小时; 蔬菜、水果洗净后用 0.2%的溶液浸泡 10 分钟。 二是擦拭: 可用于消毒皮肤与污染的物品表面。 将原液稀释成 0.2%的溶液擦洗双手 1~2 分钟,再用清水洗净; 如对物体表面进行消毒,可用浓度为 0.2%~1%的过氧乙酸稀溶液,擦抹后保持 30 分钟,即能达到杀 菌目的。 三是喷雾及熏蒸: 将原液稀释至 0.2%~0.4%,关闭门窗,采用喷雾或加热熏蒸消毒方法,常用浓度为1克/立方米。喷 雾或熏蒸后密闭 20~30 分钟即可达到消毒目的,然后开窗通风 15 分钟后方可进入。对服装和大件物品表面 进行消毒也可使用这种方法。 预防篇

正确佩戴口罩应注意事项 (二)抗代谢药物? 有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似,以至可以 和特定的酶结合,从而阻碍了酶的功能,干扰了代谢的正常进行,这些物质称为抗代谢物 (Antimetabolite)。 叶酸对抗物(磺胺) 、嘌呤对抗物(6-巯基嘌呤) 、苯丙氨酸对抗物(对氟苯丙氨酸) 、尿嘧啶对抗物(5氟尿嘧啶) 、胸腺嘧啶对抗物(5-溴胸腺嘧啶)等等 (二)抗代谢药物? 磺胺药物是最早发现,也是最常见的化学疗剂,抗菌谱广,能治疗多种传染性疾病。 大多数革兰氏阳性细菌(如肺炎球菌、溶血性链球菌等) 某些革兰氏阴性细菌(如痢疾杆菌、脑膜炎球菌、流感杆菌等) 对放线菌也有一定的作用。 1934 年,德国 I. G. Farben 染料厂的 G. Domagk 一种红色染料(prontosil) ,白鼠静脉注射,可治疗 因链球菌引起的感染,但在体外却无作用。1935 年,进一步证明 prontosil 对人的链球菌病也有效。 法国人 Trefouel 和英国人 Fuller prontosil 在体内转化成了具有抑菌作用的磺胺 (三)抗生素? 1、概念 是由某些生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生物,它们在很低浓度时就能抑制或影响它种生物 的生命活动,如杀死微生物或抑制其生长。 自本世纪 40 年代以来,已找到上万种新抗生素,合成了近 10 万种半合成抗生素,但其中在临床上常用 的仅几十种。 2、作用机制 抑制细菌细胞壁合成、破坏细胞质膜、作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化、抑制蛋白质和核酸合成等。 3、细菌抗药性的产生 避免出现细菌的耐药性的措施: (1)第一次使用的药物剂量要足; (2)避免在一个时期或长期多次使用同种抗生素; (3)不同的抗生素(或与其他药物)混合使用; (4)对现有抗生素进行改造; (5)筛选新的更有效的抗生素; 本章思考题: 细菌的生长繁殖与高等动植物的有哪些异同? 其典型生长曲线可分几期,其划分依据是什么?

核 酮 糖 二 磷 酸 羧 化 酶 ( ribulose biphosphate carboxylase , 简 称 RuBisCO ) 和 磷 酸 核 酮 糖 激 酶 (phosphoribulokinase)是本途径中两种特有的酶。 利用 Calvin 循环进行 CO2 固定的生物包括绿色植物、蓝细菌、多数光合细菌(光能自养型)和硫细菌、 铁细菌、硝化细菌等(化能自养型) 。 本章小结 复习思考题

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2004.4.28

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教 203 第七章 微生物的遗传变异和育种

遗传:亲代与子代相似亲代将自身的一整套遗传物质稳定地传递给子代的功能。遗传(inheritance) 和变异(variation)是生命的最本质特性之一 (1)遗传型(genotype) 又称基因型,指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组(genome)所携带的遗传信息。遗传型是 一种内在可能性或潜力,其实质是遗传物质上所负载的特定遗传信息。 (2)表型(phenotype) 具有一定遗传型的个体,在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的形态等生物学特征的总和。 又称表现型,指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和,是其遗传型在合适环境下通过代 谢和发育而得到的具体表现。 表型是由遗传型所决定,但也和环境有关。 (3)变异 遗传型变异(基因变异、基因突变) : 指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变,亦即遗传型的改变。 遗传物质改变,导致表型改变 特点:遗传性、群体中极少数个体的行为 (自发突变频率通常为 10-6-10-9) 微生物是遗传学研究中的明星: ? ? ? 微生物细胞结构简单,营养体一般为单倍体,方便建立纯系。 很多常见微生物都易于人工培养,快速、大量生长繁殖。 对环境因素的作用敏感,易于获得各类突变株,操作性强。

第一节

遗传变异的物质基础

一、DNA 作为遗传物质 二、RNA 作为遗传物质 三、朊病毒的发现与思考 一、3 个经典实验 (一)经典转化试验 最早进行转化(transformation)实验的是 F. Griffith(1928 年) ,他以 Streptococcus pneumoniae (肺炎链球菌,旧称“肺炎双球菌”)作为研究对象。 (2)细菌培养试验 (3)S 型菌的无细胞抽提液试验 (1)从活的 S 菌中抽提各种细胞成分(DNA,蛋白质,荚膜多糖等) (2)对各组分进行转化试验 (二)噬菌体感染实验 1952 年,A.D.Hershey 和 M.Chase 发表了证明 DNA 是噬菌体的遗传物质基础的著名实验 ——噬菌体感染实验 (三)植物病毒的重建实验 为了证明核酸是遗传物质,H. Fraenkel-Conrat(1956)用含 RNA 的烟草花叶病毒(TMV)进行了著名 的植物病毒重建实验。 二、朊病的发现与思考 三、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式 (一)7 个水平 1. 细胞水平 DNA 都集中在细胞核或核质体中 3. 染色体水平 (1)染色体数 (2)染色体倍数 指同一细胞中相同染色体的套数 单倍体(heoloid) : 一个细胞中只有一套染色体。 双倍体(diploid) : 一个细胞中含有两套功能相同的染色体。 4. 核酸水平 (1)核酸种类 (2)核酸结构

(3)DNA 长度 DNA 长度即基因组的大小,一般可用 bp(碱基对,base pair) 、kb(千碱基对,kilo bp)和 Mb(百万 或兆碱基对,mega bp)作单位。 5. 基因水平 基因是生物体内一切具有自主复制能力的 最小遗传功能单位, 其物质基础是一条以直线排列、 具有特定核苷酸序列的核酸片段。 6. 密码子水平 遗传密码(genetic code)是指 DNA 链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸排列顺序。 遗传密码的信息单位是密码子(codon) ,每一密码子由 3 个核苷酸序列即一个三联体(triplet)所组 成。一般都用 mRNA 上 3 个连续核苷序列表示 7. 核苷酸水平 腺苷酸(AMP) 胸苷酸(TMP) 鸟苷酸(GMP) 胞苷酸(CMP) 5-羟甲基胞嘧啶 (二)原核生物的质粒 1. 定义和特点 质粒:一种独立于染色体外,能进行自主复制的细胞质遗传因子,主要存在于各种微生物细胞中。 质粒是一种独立存在于细胞内的复制子(replicon) 。 质粒的主要功能 质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的; 在某些特殊条件下,质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能, 从而使宿主得到生长优势。 2. 质粒的分子结构 3. 质粒的检测 4. 质粒的主要类型 (1)致育因子(Fertility factor,F 因子) 又称 F 质粒,其大小约 100kb,这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象(接合作用)有关的质 粒。 (2)抗性因子(Resistance factor,R 因子)

抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。 R100 质粒(89kb)可使宿主对下列药物及重 金属具有抗性:汞(mercuric ion ,mer)四环素(tetracycline,tet )链霉素(Streptomycin, Str)、 磺胺(Sulfonamide, Su)、氯霉素(Chlorampenicol, Cm)夫西地酸(fusidic acid,fus)并且负责这些抗性 的基因是成簇地存在于抗性质粒上。 (3)产细菌素的质粒(Bacteriocin production plasmid)

第二节 一、基因突变(genemutation)

基因突变和诱变育种

一个基因内部遗传结构或 DNA 序列的任何改变 简称突变,是变异的一种,泛指细胞内(或病毒粒内)遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的 变化,可自发或诱导产生。 突变几率一般很低(10-6~10-9) 从自然界分离到的菌株一般称野生型菌株(wild type strain) ,简称野生型。 野生型经突变后形成的带有新性状的菌株,称突变株(mutant) ,又称突变体或突变型。 (一)突变类型 1. 营养缺陷型(auxotroph) 某一野生型菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子(碱基或氨基酸)的能力,只有从周围环 境或培养基中获得这些营养或其前体物(precursor)才能正常生长繁殖的变异类型,称为营养缺陷型。 营养缺陷型的表示方法: 基因型:所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示:hisC (组氨酸缺陷型,其中的大写字母 C 同一表型中不同基因的突变) 表型:所需营养物的前三个英文字母,但第 1 个字母大写,且不用斜体:HisC 2. 抗性突变型(resistant mutant) 指野生型菌株因发生基因突变,使菌株对某化学药物或致死物理因子,产生抗性的变异类型。 表示方法:所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”的上标表示抗性,例 strr

strs 表示对链霉素敏感.
抗性突变菌株 在遗传学、分子生物学、遗传育种和遗传工程等研究中极为重要。 3. 条件致死突变型(conditional lethal mutant) 某菌株或病毒经基因突变后,在某种条件下可正常地生长、繁殖并呈现其固有的表型,而在另一种条件 下却无法生长、繁殖,这种突变类型称为条件致死突变型。 Ts 突变株即温度敏感突变株(temperature sensitive mutant,Ts mutant)是一类典型的条件致死突 变株。

4. 形态突变型(morphological mutant) 指由于突变而引起的个体或菌落形态的变异。 个体变异如可影响孢子有无、孢子颜色、鞭毛有无或荚膜有无的突变,菌落变异如可引起菌落表面光滑、 粗糙、噬菌斑的大小或清晰度等的突变。 特点: 非选择性突变 突变株和野生型菌株均可生长,但可从形态特征上进行区分。 5. 产量突变型(metabolite quantitative mutant) 通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株,称为产量突变型。 (二)突变率(mutation rate) 每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率,称突变率。 例如,突变率为 10-8 的,即指该细胞在 1 亿次细胞分裂中,会发生 1 次突变。 突变率也可用某一单位群体在每一世代(即分裂 1 次)中产生突变株(mutant,即突变型)的数目来表 示。 例如,一个含 108 个细胞的群体,当其分裂为 2×108 个细胞时,即可平均发生一次突变的突变率也是 10 。 (三)基因突变的特点 基因突变的 7 个共同点 1)自发性 各种性状的突变,可在无人为的诱变因素处理下自发地产生。 2)非对应性 指突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。 这是突变的一个重要特点,也是容易引起争论的问题 3)稀有性 自发突变虽可随时发生,但其突变率却是极低和稳定的,一般在 10-6~10-9 间。 4)独立性 突变一般是独立发生的。 某一基因发生突变不会影响其他基因的突变率。 同一细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的。 5)可诱变性 自发突变的频率可因诱变剂(mutagen)的影响而大为提高(10~105 倍) 。 6)稳定性 基因突变后的新遗传性状是稳定的、可遗传的。
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7)可逆性 野生型菌株某一性状可发生正向突变 (forward mutation) 也可发生相反的回复突变 , (reverse mutation 或 back mutation ,也称回变) 。 (四)基因突变自发性和不对应性 实验证明: 1.变量试验(fluctuation test) 2.涂布试验(Newcombe experiment) 3.平板影印培养试验(replica plating) (五)基因突变极其机制 1.诱发突变(induced mutation) 诱发突变简称诱变,是指通过人为的方法,利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手 段。 凡具有诱变效应的任何因素,都称诱变剂(mutagen) 。 (1)碱基的置换(substitution) 碱基的置换是染色体的微小损伤(microlesion) ,它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换,属于典型的 点突变(pointmutation) 。 置换的机制 ① 直接引起置换的诱变剂 一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的化学诱变剂,在体内(in vivo)或离体(in vitro)条件下 均有作用。 它们可与一个或几个碱基发生生化反应,引起 DNA 复制时发生转换,能引起颠换的诱变剂很少。 ② 间接引起置换的诱变剂 引起这类变异的诱变剂都是一些碱基类似物(base analog) 。 5-溴尿嘧啶(5-BU) 、5-氨基尿嘧啶(5-AU) 、8-氮鸟嘌呤(8-NG) 、2-氨基嘌呤(2-AP)6-氯嘌呤(6-CP) 等。 它们的作用是通过活细胞的代谢活动掺入到 DNA 分子中后而引起的,故是间接的。 (2)移码突变(frame-shift mutation,phase-shift mutation) 指诱变剂使 DNA 序列中的一个或少数几个核苷酸发生增添(插入)或缺失,从而使该处后面的全部遗传 密码的阅读框发生改变,并进一步引起转录和转译错误的一类突变。 由移码突变所产生的突变株,称为移码突变株(frame-shift mutant) 。 能引起移码突变的有效诱变剂——吖啶类染料 由吖啶类化合物诱发的移码突变及其回复突变图示: (双线部分代表正常密码子,单线部分表示不正常)

③ 在第二个密码子上缺失一个碱基 A 后引起的变化: ④ 增添一个碱基和缺失一个碱基后,其后的密码子又恢复正常: ⑤ 增添三个碱基后,只引起一段密码子不正常: ⑥ 如缺失三个碱基,也只引起一段密码子不正常: 自发突变的原因 (1)背景辐射和环境因素 例如,天然的宇宙射线等 (2)微生物自身有害代谢产物 例如,过氧化氢等 (3)DNA 复制过程中碱基配对错误 一个 1000bp 的基因自发突变频率约为 10-6 (3)染色体畸变(chromosomal aberration) 2.自发突变(spontaneous mutation) (六)紫外线对 DNA 的损伤及其修复 嘧啶对紫外线(ultraviolet ray,U.V.)的敏感性比嘌呤强,其光化学反应产物主要是嘧啶二聚体(TT, TC,CC)和水合物,相邻嘧啶形成二聚体后,造成局部 DNA 分子无法配对,从而引起微生物的死亡或突变。 1. 光复活作用(photoreactivation,photorestoration) 把经 UV 照射后的微生物立即暴露于可见光下时,可明显降低其死亡率的现象,称为光复活作用。 最明显的是在 E.coli 的实验 ① 对照:8×106 个/mLE.coli → 100 个/mLE.coli ② 试验:8×106 个/mLE.coli→----→2×106 个/mLE.coli 注 意

在一般的微生物中都存在光复活作用,在利用 UV 进行诱变育种等工作时,应在红光下进行照射和后续 操作,并放置在黑暗条件下培养。在利用 UV 进行杀菌时,黑暗条件下 2.切除作用(excision repair) 是活细胞内一种用于修复被 UV 等诱变剂 (包括烷化剂、 射线和γ 射线等) X 损伤后 DNA 的修复方式之一, 又称暗修复(dark repair) ,通过酶切作用去除嘧啶二聚体,随后重新合成一段正常 DNA 链的核酸修复 方式。

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教 307

二、突变与育种

(一)自发突变与育种(breeding by spontaneous mutation) 1. 从生产中育种 在生产第一线易获得较优良的生产菌株。 2. 定向培育优良菌株、 定向培育是一种利用微生物自发突变,并采用特定的选择条件,通过对微生物群体不断移植以选育出较 优良菌株的古老方法。 (二)诱变育种(breeding by induced mutation) 诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群,在促进其突变率显著提高的基 础上,采用简便、快速和高效的筛选方法,从中挑选出少数符合育种目的的突变株,以供科学实验或生产实 践使用。 1. 诱变育种的基本环节 2. 诱变育种中的原则 (1)选择简便有效的诱变剂 (2)挑选优良的出

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