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实验十二 血清肌酸激酶测定与应用_图文


实验十二 血清肌酸激酶测定与应用

1 实验目的
⑴ 了解血清肌酸磷酸激酶测定的方法。 ⑵ 掌握其测定的应用与意义。

2 实验原理
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肌酸激酶( Creatine phosphokinase ,简称 CK ) 广泛存在于骨骼肌、心肌和脑组织中,肝脏和红 细胞等不含此酶。骨骼肌中含量最丰富,占全身 总量的96%之多。 肌酸磷酸激酶在肌肉收缩中很重要,它催化下列 反应:

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上述反应保证肌肉收缩时的能量供应和运动后 ATP和肌酸磷 酸的再合成。正常人血清中肌酸磷酸激酶主要由骨骼肌和 心肌细胞透过细胞膜进入血液的结果,其活力很小。正常 值每升血液中100活力单位以下。

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运动训练能使血清肌酸酸磷酸活性升高。其原因一般认为 运动时缺氧 , 代谢产物积累,供能相对不足等原因,引起 肌细胞膜通透性升高。或肌细胞膜受到损伤,促使 CK从细 胞内释放增加,进入血液循环,其中以肌肉牵拉的机械性 损伤或产生血肿等原因最为重要。

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滑雪运动和马拉松赛跑后,血清CK的活性较高,特别是大 强度的马拉松赛跑最高。在运动后 4 小时升高, 8-16小时 达最高值。跳跃、短跑等短时间激烈运动,冲击性运动, 也易引起CK活性升高。大运动量的训练和100m、200m跑比 赛后,血清中CK活性都显著升高,尤其是在比赛时,升高 更为显著。

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应用肌酸磷酸激酶来作机能评定时,一般认为 2-3天取血 测定一次 , 在负荷后经常处于 100-200国际活力单位 /L 。 如果超过 200IU/L,就是运动量过大,身体尚未恢复,此 时应调整运动量。

3 实验器材与试剂
⑴ 器材

⑴ 器材 试管、分光光度计、分析天平、采血 装置(注射器)、水浴箱、离心机

⑵ 试剂 ① 混合底物 ? pH 7.4 三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液:称取三羟甲基氨基 甲烷( Tris ) 2.4g ,加蒸馏水至 100 ml ,再加入 0.2 N 盐酸 88.8 ml 及无水硫酸镁 0.34g ,调节 pH 至 7.4 。此液在室温下 可保存数月。 ? 0.012 M 磷 酸 肌 酸 溶 液 : 称 取 磷 酸 肌 酸 钠 ( C4H8O5O4PNa3·6H2O)436 mg,加蒸馏水至 100 ml,调节PH至7.4, 保存于-25℃或普通冰箱上层冰盒中,可用一个月左右。 ? 0.001 M ADP溶液:称取ADP钠盐0.233g,加蒸馏水至100 ml, 调节PH至7.4,保存于-25℃或冰箱上层冰盒中,可用一个月 左右。

临用前,取上述(1)(2)(3)试剂各10 ml混合。 ? 在此混合底物液 30 ml 中,加入盐酸半胱氨酸 0.105g ,调节 PH 至 7.4。此试剂最好新鲜配制,也可以保存于冰盒中。一般可放5-7 天,若空白管光密度太高,说明有游离肌酸产生,即不能再用。 ② 0.3 N 氢氧化钡溶液 称 取 氢 氧 化 钡 ( Ba(OH)2·8H2O ) 4.73g , 加 蒸 馏 水 使 之 溶 解 (可加热助溶),并稀释到100 ml。 ③ 5% 硫酸锌溶液 ? 称取硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.82g,加蒸馏水溶解,并稀释到100 ml。 ? 上述 2 、 3 两种溶液配好后,需进行滴定,即吸取 5% 硫酸锌溶液 5 ml , 放 入 50 ml 三 角 烧 瓶 中 , 加 入 酚 酞 指 示 剂 2 滴 , 用 0.3 N Ba(OH)2溶液滴定至出现粉红色30秒钟不褪色为止。 Ba(OH)2用量 与ZnSO4相等,如不相等,可稀释较浓的溶液。
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④标准肌酸溶液(1.7μ M/ml) 准确称取无水肌酸 22.3mg,置于 100ml 容量瓶中,加蒸 馏水使之溶解,并稀释到刻度,置冰箱中保存,可用数日。 ⑤双乙酰液 先配成 1% 溶液,置棕色瓶中放冰箱保存。临用时用蒸 馏水稀释20倍。 ⑥贮存碱溶液 称取30g NaOH ,无水碳酸钠( Na2CO3) 64g ,加蒸馏水 使溶解并稀释至 500 ml ,室温低时可析出沉淀,此时应放 于37℃水浴中待沉淀溶解后再使用。 ⑦α -萘酚溶液 称取 α - 萘酚 1g ,用上述贮存碱液使溶解,并稀释到 100 ml ,此液必须新鲜配制,否则空白管光密度读数增高。

4 实验方法与步骤
⑴ 肌 酸 磷 酸 激酶显 色法

⑴肌酸磷酸激酶显色法。 ①测定 CK 活性原理:利用上述反应所生成的肌酸与 α - 萘酚 和双乙酸反应,生成红色化合物。在一定范围内,红色深 浅与肌酸含量成正比,与同样处理的肌酸标准液比色,求 得酶的活力。

②测定操作步骤(如下表3-14):
表3-14 单位: ml

加入物(ml) 混合底物 血清 标准肌酸(1.7μM/ml)
蒸馏水 Ba(OH)2溶液 ZnSO4溶液 蒸馏水

空白管 0.75 - -

标准管 0.75 - 0.1

测定管 0.75 0.1 -

0.1 - - 置37℃水浴保温30 min 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀,离心5-10 min

上清液

1. 1. 1.

0.5

1. 1.

0.5

1. 1. 1.

0.5

α-萘酚溶液
双乙酰液

1

1

1
0.5

0.5 1. 0.5 置37℃水浴保温15 min

蒸馏水

3 1. 3 1. 3 离心3~5min, 520nm波长处进行比色 读取各管的光密度
1.

计算:

⑵ 肌酸磷酸激酶检测试剂盒法:
① 原理 ATP+葡萄糖 葡萄糖-6-磷酸+ADP 为作用酶 葡萄糖-6-磷酸+NADP+ 6-磷酸-葡萄糖+NADPH+H+ 为作用酶

② 器材与试剂:试管、可见光分光光度计、电子分析天 平、采血装置(注射器)、水浴锅、离心机、试剂盒测 定法。 如:采用中生北控生物科技股份有限公司生产的肌酸磷 酸激酶检测试剂盒,该试剂盒适用于全自动,半自动生 化分析仪及分光光度计测定人血清中CK的酶活浓度。
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基本参数:波长:340 nm,温度:25℃,30℃,37℃,比 色杯光径:1cm。

试剂盒主要成分与浓度,见表3-15:
表3-15 肌酸磷酸激酶检测试剂盒成分与浓度
试剂 R1 主要成分 己糖激酶(HK) 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶( G6PDH) 实验浓度 ≧3000 U/L ≧2000 U/L

ADP
AMP Ap5A NADP NAC 磷酸肌酸

2 mmol/L
5 mmol/L 10 ūmol/L 2 mmol/L 20 mmol/L 30 mmol/L

R2

咪唑缓冲液(pH 6.7,25℃)
葡萄糖

100mmol/L
20mmol/L

原装试剂杂2-8℃避光保存,有效期12个月。复溶后在2-8℃可稳定7天,在 15-25℃可稳定12小时。

③ 操作步骤:取一定量R2(参看R1瓶签)复溶1瓶R1, 溶解后即为工作液。工作液预先保温至测试温度。 表3-16 肌酸磷酸激酶检测试剂盒的操作
加入物(ml) 工作液 蒸馏水 样品 空白管 2.50 2.50 — 样品管 0.50 — 0.50

混合均匀,在37℃温育2分钟后,读取初始吸光度,然后在精 确1分钟,2分钟,3分钟时分别读取吸光度,确定每分钟平均 吸光度变化⊿A。

④计算: CK(U/L)=(⊿A样品/分—⊿A空白/分)×F F=(Vt/Vs×消光系数) ×1000=8095(37℃) Vt=反应总体积 Vs=样品体积 NADPH在340 nm波长下毫克分子消光系数=6.3 参考值:男:24-195 U/L;女:24-170 U/L 线性上限:CK活力可达1500U/L(37℃)

⑤注意事项:当⊿ A/ 分大于 0.0360 ( F=4127 ), 0.0190 ( F=8095 )时,样品用生理盐水稀释后重新测定, 结果 乘以稀释倍数;试剂空白吸光度大于 0.6时,勿用;血清CK 不稳定,样品收集后要尽快分析,在室温 4 小时,在 4℃ 8-12小时后,CK活性即要下降。

5 注意事项
⑴ 红细胞中肌酸磷酸激酶活力很低,故溶血标本不影响测 定结果。 ⑵ 混合底物的pH要求准确。 ⑶ 氧氧化钡和硫酸锌要滴定至恰好等量,否则离心后会出 现混浊。特别是钡离子多时,不能完全被硫酸根清除尽, 使显色混浊而影响测定结果。 ⑷ 肌酸磷酸激酶活力单位定义:以 1 ml 血清在 37℃与底物 作用1小时,生成1μ M肌酸为1个肌酸磷酸激酶活力单位。 ⑸ 酶的活力太高时,应将血清用 Tris-HCl 缓冲液稀释后再 行测定,结果乘以稀释倍数。 ⑹ 因α -萘酚本身颜色不恒定,试剂空白每次深浅不同,故 不能用标准曲线工作法。

6 思考题
⑴ 血清 CK 活性是赛前进行机能评定的一项 重要指标,试述其理由。 ⑵ 采血时挤压组织对结果有何影响?


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